摘要：为探究二花脸猪隐睾组织学特点和PCNA/CD31的差异性表达,本试验以二花脸猪隐睾和正常睾丸组织作为研究对象,通过组织特殊染色观察分析猪隐睾组织学特点,同时利用蛋白免疫印迹、免疫组织化学和免疫荧光等实验,检测PCNA/CD31蛋白在隐睾和正常睾丸组织中的差异性表达,为研究隐睾的发生机制和种公猪睾丸发育的检测提供实验数据和理论依据。组织学分析结果显示,HE染色观察隐睾组织睾丸小叶界限不清、间质细胞多而散乱分布、曲精小管直径明显减小,管腔内可见大量精原细胞及支持细胞;VG和Ag NOR染色观察睾丸结缔组织和曲精小管基膜中呈红色的胶原纤维较少,且胶原纤维分布紊乱,核分裂相细胞较少。蛋白免疫印迹检测PCNA/CD31在隐睾组织中的表达均显著高于正常睾丸组织(P<0.01)。免疫组织化学结果显示,PCNA/CD31在隐睾和正常睾丸组织中都存在阳性表达,PCNA在隐睾和正常睾丸结缔组织的血管壁和间质细胞的胞质中强阳性表达,在胞核中也可见少量阳性表达;CD31表达于隐睾和正常睾丸组织间质细胞的胞质中,而在细胞膜和胞核中未见表达。结果表明,PCNA/CD31参与了睾丸间质细胞的增殖和分布、血管的生成及曲精小管的发育,是诱导猪隐睾发生的关键因子。

摘要：MUC4和MUC13基因作为产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coil,ETEC)F4的重要抗性候选基因,可能在断奶仔猪抗ETEC F18菌株的感染过程中发挥重要作用,因此本试验运用实时荧光定量PCR法分析了MUC4和MUC13基因在梅山猪ETEC F18抗性型和易感型个体11个组织(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、肌肉、胸腺、淋巴结、十二指肠和空肠)中的表达水平及差异。结果显示,MUC4和MUC13基因在检测的11个组织中均有不同程度的表达。其中,在胸腺和淋巴组织中,MUC4基因在抗性型个体中的表达水平显著高于易感型个体(P<0.05);在肺脏组织中,MUC13基因在抗性型个体中的表达水平显著高于易感型个体(P<0.05),且MUC13基因在抗性群体肠道中的表达水平较高。由此推测,MUC4基因在免疫组织、MUC13基因在肠道组织的高表达可在一定程度上提高了机体的免疫能力,保护和润滑肠道,从而抵抗ETEC F18菌株对机体的感染。

摘要：肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor,TNF-α)基因在机体固有免疫和炎症反应中发挥重要作用,本研究旨在分析大白猪TNF-α基因启动子区C-791T多态性及其与基因表达之间的关系,为分析TNF-α基因启动子区C-791T突变的遗传学效应提供科学依据。本试验利用PCR-SSCP方法对201头大白猪TNF-α基因启动子区C-791T位点多态性进行检测,同时利用Real-time PCR方法分析TNF-α基因C-791T位点不同基因型在大白猪11个组织中的mRNA差异表达情况。结果表明,大白猪TNF-α基因启动子区-791bp处存在碱基突变(C>T),并检测到3种基因型,分别为:CC、CT和TT。TNF-α基因在断奶仔猪脾脏、肺脏、胸腺和淋巴结等免疫器官中表达量均较高;TT和CT基因型个体在11个组织中TNF-α基因表达量普遍高于CC基因型个体,且在十二指肠及空肠组织中达到差异显著性水平(P<0.05)。因此,TNF-α基因启动子区C-791T突变对该基因的mRNA表达水平产生显著影响,有必要将TNF-α基因启动子区C-791T位点多态性作为提升机体肠道病原菌抗性的遗传标记进行深入研究。

摘要：本试验运用亚硫酸氢盐(BSP)+Miseq测序法分析苏太断奶仔猪F18大肠杆菌抗性型和敏感型个体十二指肠和空肠组织TAP1基因启动子区的甲基化水平,并运用real-time PCR(RT-PCR)方法检测TAP1的m RNA表达量,进而分析TAP1基因启动子区甲基化修饰对m RNA表达的影响,探讨TAP1基因启动子区甲基化修饰对F18大肠杆菌抗性的调控作用。结果表明:TAP1基因启动子区2个Cp G岛及其中间区域内存在28个Cp G位点,且都存在不同程度的甲基化;其中在Cp G-6位点,抗性型个体空肠组织中的甲基化水平显著低于敏感型个体的甲基化水平(P<0.05);在Cp G-7和Cp G-8位点,抗性型个体十二指肠组织中的甲基化水平显著高于敏感型个体的甲基化水平(P<0.05);Cp G-7和Cp G-8位点甲基化水平与TAP1基因m RNA表达量呈负相关。本实验结果显示,Cp G-6、Cp G-7和Cp G-8是调控基因转录水平的关键性位点,断奶仔猪可能通过对TAP1基因启动子区Cp G岛这些关键位点的去甲基化来提高十二指肠和空肠组织中m RNA的表达水平,进而发挥对*** F18抗性的调控作用。

摘要：Toll样受体5 (TLR5)是Toll-like受体家族中的重要成员,在革兰阴性菌引起的炎症反应中发挥着重要的调控作用。通过CRISPR/Cas9基因敲除技术对猪肺泡巨噬细胞(PAMS)的TLR5基因进行敲除,然后经菌落计数,检测TLR5基因敲除后对大肠埃希菌F18ab和F18ac以及沙门菌黏附能力的影响。结果表明:设计的2条sgRNAs成功插入CRISPR/Cas9载体中,序列正确,转染猪肺泡巨噬细胞后均能稳定表达,且PCR测序峰图出现套峰,表明敲除载体具有切割活性。利用有限稀释法,最终获得1株缺失15个碱基的单克隆细胞系TLR5-sg1。对TLR5敲除细胞进行qPCR和Western blot验证,结果显示TLR5基因的转录水平极显著下调,其蛋白质水平也明显降低。细菌黏附试验结果显示,TLR5敲除细胞中黏附的大肠埃希菌F18ab、F18ac和沙门菌(ATCC13312)的数量均极显著低于对照组。这一研究成功建立了猪TLR5基因敲除的3D4/21细胞系,且TLR5基因的敲除会降低大肠埃希菌和沙门菌对3D4/21细胞的黏附能力,为进一步探究TLR5基因的生物学功能建立了细胞模型,为深入探讨TLR5基因在炎症反应中的免疫调控作用提供了试验素材。

摘要：为了进一步探究猪LTβR基因的生物学功能,本研究以猪淋巴组织cDNA为模板扩增LTβR基因CDS区,进一步利用生物信息学对猪LTβR蛋白结构与功能以及参与的GO和Pathway通路进行分析,利用Real-time PCR检测LTβR基因在大白猪不同组织中的表达水平,同时将LTβR基因扩增产物克隆至真核表达载体pEGFPC1中,并分别转染猪HEK293和IPEC-J2小肠上皮细胞系,通过显微镜观察其表达情况。结果表明,克隆获得猪LTβR基因CDS区全长为1 209bp,编码402个氨基酸,发现LTβR为脂溶亲水性的不稳定蛋白,存在1个跨膜结构(205~227aa),不存在信号肽,亚细胞定位表明LTβR为非分泌型蛋白。LTβR蛋白具有2个糖基化位点,18个潜在的磷酸化位点,其中包括PKC、CKI、CDC2、GSK3、CDK5、INSR等10种保守的特异性蛋白质激酶的结合位点。该蛋白保守区域为2个TNFR superfamily,分别位于32~125和128~192位氨基酸,并发现C422T>A141V突变位于该区域内。KEGG和GO分析发现,LTβR基因共参与12项GO功能分类,同时还参与NF-kappa B信号通路、IgA合成的肠道免疫网络等5项调控通路。定量检测发现,LTβR基因在大白猪肺中的表达水平极显著高于其他组织(P<0.01),在肾和脾等免疫器官,十二指肠和空肠等肠道组织中也均有较高的表达水平。细胞水平转染试验及显微镜观察发现其在猪HEK293和IPEC-J2两种细胞中均表达。本研究为猪LTβR基因及其介导的信号通路的功能分析提供了材料和依据,今后有必要在细胞水平上进一步验证分析猪LTβR基因及其介导的信号通路在猪抵抗细菌感染过程中发挥的重要作用,同时将C422T突变作为猪抗病育种的一个潜在遗传标记进行系统分析。

摘要：猪α-(1,2)岩藻糖转移酶2(FUT2)基因为鞘糖脂生物合成—球系列通路中的重要基因,可能在断奶仔猪抵抗大肠杆菌F18侵染过程中发挥着调控作用。为探究猪FUT2基因的序列结构及其生物学功能,试验采用PCR扩增得到地方猪品种东串猪FUT2基因的CDS全序列,进而预测和分析FUT2基因的蛋白质序列及其功能区域,同时对其在8头35日龄东串断奶仔猪11个组织中的表达水平进行检测与分析。结果显示,FUT2基因的CDS序列全长为1 023bp,共编码340个氨基酸,FUT2蛋白为脂溶性的亲水蛋白,蛋白结构不稳定,该蛋白存在1个跨膜螺旋结构,但不存在信号肽,表明FUT2蛋白为膜蛋白;FUT2蛋白存在2个N-糖基化位点(185和305位氨基酸),无O-糖基化位点,此外该蛋白还存在14个潜在的磷酸化位点,包括6个Ser、2个Thr和6个Tyr,对其功能区域进行分析发现,FUT2蛋白存在1个超级家族保守结构域:FUT1-FUT2-like(58-319位氨基酸);系统进化树结果显示,猪与牛的亲缘关系相对较近,与人、黑猩猩、大鼠和小鼠等亲缘关系相对较远;FUT2基因在东串断奶仔猪11个组织中均有表达,在消化道和免疫组织中表达水平较高。试验结果推测FUT2基因在断奶仔猪抵抗大肠杆菌F18中可能具有一定的作用,且可能是通过合成岩藻糖转移酶间接发挥其抵抗大肠杆菌F18的作用。

摘要：本试验通过0.1和1μg·mL-1浓度的LPS诱导处理猪小肠上皮细胞(IPEC-J2),分别在2、4、6h时利用实时荧光定量PCR方法检测TLR4及其信号通路相关基因(CD14、MyD88、TNF-α、IL-1β和IFN-α)mRNA水平相对表达量,初步探讨猪小肠上皮细胞受到产肠毒素大肠杆菌侵扰发生炎症反应的相关分子反应机理。结果发现,两种浓度的LPS均使得所检测的TLR4及其信号通路相关基因表达量上调,诱导后4~6h的表达量急速上升,且高浓度的LPS诱导处理后各基因表达量上调倍数明显高于低浓度LPS诱导时各基因表达量上调倍数,高浓度的LPS对机体肠道的刺激引起了更为强烈的免疫反应,使正常机体更快地产生炎症反应。由此推测,大肠杆菌侵染猪肠道后将释放LPS,TLR4作为LPS的受体,受LPS诱导其表达量上调,进而引起TLR4信号途径的信号传递,传递过程中由于MyD88的依赖机制,MyD88表达量上调相对稳定,再经过级联免疫放大效应,大量的促炎细胞因子释放,导致炎症及腹泻水肿病的产生。

摘要：文章采用PCR-SSCP方法对亚洲野猪、3个引进的商业化品种和10个中国地方猪品种共893个个体TLR4基因外显子1的遗传变异进行了检测,旨在系统分析国内外猪种TLR4基因的多态性,为探讨该基因在免疫和防御系统中发挥的作用提供依据。结果,在猪TLR4基因外显子1中分离到新的等位基因,共检测到3个等位基因,6种基因型。其中杜洛克检测到AA、BB、CC、AB、AC、BC基因型,有杜洛克血统的苏太猪中检测到BB、CC、BC基因型,长白猪、约克夏中检测到CC、BC基因型,野猪及所有10个中国地方猪品种TLR4基因外显子1高度保守,只检测到CC基因型,中国地方猪品种和引进品种TLR4基因外显子1多态性存在极显著的差异。3种基因型中CC型与GenBank中的序列一致,BB和AA基因型分别存在G93C同义突变位点和G194A无义突变位点,这2个变异位点与抗逆性和一般抗病力的关系值得进一步深入研究。

摘要：本研究统计分析了部分非遗传因素（胎次、产仔月份及纯繁／杂交）对长白、大白和杜洛克母猪产仔性能（总产仔数、产活仔数及初生窝重）的影响，旨在为后备母猪的选种提供指导。结果表明，2～5胎仔猪的初生窝重较重；其中2、3胎的初生窝重极显著高于头胎及6胎之后的仔猪初生窝重（P〈0．01）。3月份总产仔数、产活仔数及初生窝重极显著高于其他月份（P〈0．01），且11月份初生窝重显著低于其他月份（P〈0．05）。长白纯繁母猪在产活仔数方面极显著优于大白纯繁母猪和长白×大白杂交母猪（P〈0．01）；在初生窝重方面，大自×长白杂交母猪的初生窝重极显著高于大白纯繁母猪和长白×大白杂交母猪（P〈0．01）。第2胎与3～4胎、第3胎与第4胎的总产仔数呈极显著正相关（P〈0．01）。综上所述，该猪场母猪3～6胎的产仔性能较好，且以1～4月份的产仔性能为佳；配种方式以长白纯繁和大白×长白杂交为宜；第2胎产仔性能可作为后备母猪选留的重要依据。