摘要：对茅苍术脂肪酸β-氧化途径中关键酶3-酮脂酰-CoA硫解酶(KAT)基因进行克隆并开展生物信息学分析、原核表达和基因表达分析,为研究茅苍术脂肪酸β-氧化机制奠定基础。根据茅苍术转录组数据中KAT基因序列信息,设计特异性引物,采用RT-PCR方法克隆获得茅苍术3-酮脂酰-CoA硫解酶基因全长序列,命名为AIKAT(GenBank登录号为MW665111)。结果分析表明,AIKAT基因的开放阅读框(ORF)为1 323 bp,编码440个氨基酸,推测其相对分子质量为46 344.36,蛋白理论等电点为8.92。通过在线工具预测AIKAT为稳定的碱性蛋白,跨膜结构域分析表明AIKAT无跨膜结构,二级结构显示其主要由α-螺旋结构组成,利用同源建模进行三级结构预测;同源氨基酸序列分析表明茅苍术与黄花蒿、洋蓟、地黄、拟南芥KAT编码的氨基酸序列具有较高的同源性;系统进化树分析显示AIKAT与洋蓟CcKAT2聚为一支,证实了菊科3-酮脂酰-CoA硫解酶基因的同源性;构建原核表达载体pET-32a-AIKAT并转化至大肠杆菌BL21 (DE3)表达感受态进行诱导表达,在64 kDa处成功表达出目的蛋白;利用实时荧光定量PCR技术检测了茅苍术3个组织中的AIKAT基因表达量,结果显示AIKAT在根状茎中表达量最高,其次是叶、茎。该研究首次克隆得到AIKAT基因,使其重组蛋白在大肠杆菌中成功表达,并验证了其在不同组织中存在差异表达,为进一步研究茅苍术脂肪酸β-氧化途径奠定了基础。

摘要：目的克隆天麻糖基转移酶基因(glycosyltransferase,Ge GT1)的全长cDNA序列,进行序列分析和原核表达分析,并探究该基因在天麻不同器官中的表达规律。方法在天麻转录组数据库中通过注释和比对,用PrimerPremier5.0软件设计基因特异性引物。通过反转录聚合酶链式扩增(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)方法从天麻块茎中克隆得到Ge GT1全长cDNA序列,利用生物信息学软件预测基因编码蛋白的特征;利用Clustal W和MEGA6.06软件构建GeGT1的系统进化树;构建原核表达载体pET-28a-GeGT1,转化至大肠杆菌Transetta(DE3)进行诱导表达;通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q RT-PCR)技术分析基因表达模式。结果Ge GT1基因开放阅读框(open reading frame,ORF)全长1503 bp,编码500个氨基酸,蛋白相对分子质量为55494.33,理论等电点为5.51,为稳定的酸性蛋白。襄襆襈襌襐襒襔襠襢襦襨襶襼覊覌覚覜覦覨覮覰覸覺覼覾览觊角觔觜膜结构域,无信号肽,为非分泌蛋白。通过序列同源性分析,GeGT1与铁皮石斛具有较高的同源性。系统进化树分析证实了兰科植物糖基转移酶基因的同源性。SDS-PAGE结果显示,诱导表达蛋白为63000,与预期蛋白大小一致。基因表达结果显示,Ge GT1基因的表达水平在花中最高,其次是块茎、茎。结论首次克隆并分析了Ge GT1基因,建立了原核表达体系,为进一步研究天麻活性成分合成的分子机制奠定基础。