摘要：背景:内皮细胞基础培养液主要用于培养内皮祖细胞,作者所查用此液培养间充质干细胞的报道较少。目的:对以内皮细胞基础培养液为基础的不同方法培养脐血间充质干细胞的效果比较。设计、时间和单位:对比观察的细胞培养实验,于2005-09/2006-05在上海市新华医院市级重点实验室完成。材料:选取妊娠杂交犬8只,抽取脐血进行干细胞的分离和培养。内皮细胞基础培养液及内皮细胞培养基为美国Clonetics产品。鼠抗CD11a单克隆抗体,鼠抗CD11b单克隆抗体,鼠抗CD29单克隆抗体,鼠抗CD71单克隆抗体均为美国Antibodydiagnostica产品;鼠抗CD34单克隆抗体为美国LabVisionCorporation产品。方法:收集的脐血干细胞分为A,B,C,D4组。A组用内皮细胞基础培养液培养;B组用添加有微血管内皮细胞生长培养液的内皮细胞基础培养液在6孔板上培养。C组用添加有内皮细胞培养基的内皮细胞基础培养液在纤维连接蛋白包被的6孔板上培养。D组用添加有内皮细胞培养基的内皮细胞基础培养液在25cm2细胞培养瓶中培养。主要观察指标:观察各组细胞形态学变化和群体倍增数。应用免疫组化法检测细胞抗原CD11a、CD11b、CD34、CD29及CD71的表达。结果:各组均有成纤维细胞样细胞培养出。A组细胞形态不良,增殖缓慢;B组细胞增殖旺盛;C组细胞克隆不稳定,容易老化;同时出现另一种细胞克隆。D组细胞培养的结果与C组相似。免疫组化法检测抗原显示CD11a(-),CD11b(-),CD34(-),CD29(+)及CD71(+)。结论:在未经处理的6孔板上,用添加有内皮细胞培养基的内皮细胞基础培养液细胞培养液可以培养出生长良好、增殖旺盛的间充质干细胞。应用纤维连接蛋白和25cm2细胞培养瓶培养的效果不佳。

摘要：背景:目前对几种脱细胞方法的效果各家观点不同。大都认为各种方法均可去除细胞,但实验结果却有较大差异。目的:对比胰蛋白酶法、十二烷基硫酸钠法和去氧胆酸钠法去除细胞后心脏瓣膜形态学及生物力学特征。设计、时间及地点:对比观察实验,于2007-10/2008-07在上海交通大学医学院细胞生物学实验室和上海交通大学医学院附属新华医院进行。材料:40个新鲜猪主动脉瓣120片瓣叶分为3组,分别为胰蛋白酶组、十二烷基硫酸钠组和去氧胆酸钠组,每组40片。方法:胰蛋白酶消化法:置于0.5g/L胰蛋白酶和0.2g/L乙二胺四乙酸,在37℃,体积分数为0.05CO2培养箱中振荡24h。十二烷基硫酸钠法:置于0.3g/L十二烷基硫酸钠和DNase,RNase中持续振荡24h。去氧胆酸钠法:首先在5g/LTriton-X100,5g/L去氧胆酸钠,0.2g/L乙二胺四乙酸中振荡24h,然后在2.5g/LTriton-X100,2.5g/L去氧胆酸钠和0.2g/L乙二胺四乙酸中破膜去污振荡48h,两阶段均加入DNase,RNase。主要观察指标:3种方法去细胞前后心脏瓣膜的生物力学特性变化。3种方法去除细胞程度和对胶原纤维、弹力纤维的影响。结果:去氧胆酸钠组拉伸率、最大拉伸应力、最大载荷均高于十二烷基硫酸钠组和胰蛋白酶组(P<0.01)。胰蛋白酶法脱细胞效果差,对基质破坏明显;十二烷基硫酸钠法可完全脱细胞,对基质破坏较大;去氧胆酸钠法完全脱细胞同时对基质破坏较少。结论:与胰蛋白酶法、十二烷基硫酸钠法比较,去氧胆酸钠法脱细胞效果好,能更好保护基质。

摘要：背景:脐血间充质干细胞诱导分化为心肌细胞后移植入心肌缺血组织,可以通过与宿主细胞建立联系来修复取代缺血心肌组织。目的:对犬脐血干细胞进行肌源性诱导,观察其植入后与宿主细胞间的连接情况。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-07/2007-10在上海交通大学医学院附属新华医院动物实验中心完成。材料:接近足月的妊娠杂种犬2只,用于分离培养脐血间充质干细胞。成年杂种犬36只,随机数字表法分为细胞移植组、模型对照组,18只/组。方法:取传至第4代的犬脐血间充质干细胞,加入含lacZ基因的重组腺相关病毒载体进行基因转染,继续培养3d后,行10μmol/L5-氮杂胞苷肌源性诱导,常规培养3周。两组犬均建立心肌梗死模型,造模后细胞移植组经冠状动脉和局部注射将2mL细胞悬液(约107个脐血间充质干细胞)移植到梗死区,模型对照组同法注射等量生理盐水。分别于移植后2,4,8周取材制备心肌组织切片,免疫组化检测细胞间连接情况。主要观察指标:脐血间充质干细胞的基因转染、肌源性诱导分化情况,移植细胞与宿主心肌细胞的细胞间连接情况。结果:转染72h后大部分细胞表达LacZ基因,并合成半乳糖苷酶,X-gal染色呈蓝色。5-aza诱导3周后,脐血干细胞α-Actin(+),Desmin(+),Connexin43(+),而诱导前均呈阴性。移植后第8周,心肌切片中移植细胞和宿主心肌相连处可形成连接,连接处可见cadherin和connexin43绿色荧光阳性表达;模型对照组仅表达cadherin和connexin43,未见带红色荧光的移植细胞。结论:脐血间充质干细胞可在体外诱导为心肌样细胞,移植后能与宿主心肌可能形成有效连接,从而具有通讯联系。

摘要：背景:细胞凋亡与心肌梗死后的心室重构之间互为因果,形成恶性循环,如何减少心肌梗死后的凋亡事件是挽救心功能的关键之一。目的:观察脐血间充质干细胞移植对犬急性心肌梗死后残存心肌细胞的影响。设计:随机对照观察。单位:上海交通大学附属新华医院心胸外科。材料:实验于2005-10/2007-05在上海交通大学附属新华医院中心实验室完成。选用36只成年杂种犬,雌雄各半,由上海交通大学附属新华医院动物实验中心提供。方法:采用随机数字表法将36只犬分为细胞移植组和对照组,每组18只。自近足月的妊娠杂种犬脐血中提取、培养、扩增间充质干细胞,Laz基因标记,经5-氮胞苷体外诱导后移植入细胞移植组急性心梗模型犬,对照组同法注射生理盐水。移植后1,4,8周后麻醉处死各组实验犬,获取心肌标本。主要观察指标:①TUNEL检测残存凋亡指数。②共聚焦显微镜检测心肌细胞体积及组织形态学检测。③苏木精-碱性复红-苦味酸染色检测心脏胶原网络的组织学变化。结果:纳入实验犬36只,均进入结果分析。①细胞移植后1,4,8周移植组的凋亡指数均低于对照组,差异有显著性意义(P<0.05)。②移植组移植后1,4,8周心肌细胞体积均高于对照组,差异有显著性意义(P<0.05)。③移植组心肌组织内胶原纤维排列整齐、规律,对照组排列较紊乱、无规律,部分发生融合。结论:脐血间充质干细胞移植后可通过减少心肌细胞凋亡,促使残存心肌细胞肥大,调节心肌胶原网络从而改善心功能。

摘要：背景:人体内存在一种能以血管发生方式形成新生血管的内皮祖细胞,更新了传统意义上的出生后血管生成、血管损伤修复的理论。目的:观察犬脐血血管内皮祖细胞移植对梗死心肌血管形成的影响。设计、时间及地点:细胞学体内实验,于2006-05/2007-03在新华医院实验中心完成。材料:接近足月的妊娠杂种犬1只,用于制备脐血血管内皮祖细胞;成年犬36只,随机分为细胞移植组、模型对照组,18只/组。方法:2组犬均于冠状动脉前降支第1对角支分出后结扎建立急性心肌梗死模型。细胞移植组向冠状动脉内注射含5×106个血管内皮祖细胞(经BrdU标记)的生理盐水2mL,模型对照组同法注射单纯等量生理盐水。移植后1,4,8周处死取材。主要观察指标:心肌标本苏木精-伊红染色确认梗死模型,BrdU免疫组化染色观察心肌血管新生情况,vW因子染色观察梗死心肌血管数。结果:心肌梗死区可见大量的瘢痕组织、成纤维细胞以及小血管形成。细胞移植组梗死心肌区小血管上可见部分细胞核内有棕黄色颗粒,BrdU呈阳性表达;模型对照组无明显新生血管。细胞移植组在心肌缺血区和梗死区血管内皮细胞的胞浆内有棕黄色颗粒,vW因子呈阳性表达;模型对照组不表达vW因子。心肌梗死后第1,4,8周,细胞移植组和模型对照组的心肌缺血区、梗死区的血管数均无明显差异(P>0.05)。结论:犬脐血血管内皮祖细胞移植至梗死心肌后可参与血管形成,但尚不能够促进心肌的血管再生。