摘要：应用反向遗传技术对新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）LaSota株感染性克隆PBRN—FL质粒进行操作，构建插入欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）ORF5基因的重组质粒LaSota-ORF5并进行病毒拯救及鉴定。依据GenBank所发表的欧洲型PRRSVLV株ORF5序列，设计引物扩增0RF5片段，通过PBRN—FL质粒上P和M基因间的PmeI酶切住点插入目的片段，构建重组质粒LaSota—ORF5。采用磷酸钙转染法将重组质粒和PCI—NP、PCI-P、PCI—L等3种辅助质粒共转染BSR—T7／5／细胞拯救病毒并对其分别进行RT-PCR、间接免疫荧光（IFA）和Western blot（WB）试验鉴定。结果显示：拯救病毒的RT-PCR产物测序结果正确，IFA出现绿色荧光，WB试验条带大小符合预期，证明GP5蛋白有效表达。结果表明：成功构建并拯救得到重组病毒rLaSota-GP5，为制备表达PRRSVGP5蛋白的重组NDV疫苗奠定基础。

摘要：目的以猪源新城疫病毒JL02/2000株为模板,构建新城疫病毒反向遗传研究所需的基因起始片段。方法将NDV起始片段(ND1,226-4 916bp)设计拆分为ND1-1、ND1-2、ND1-3、ND1-4的4个约1.2kb的小片段,分别PCR扩增各片段,后采用SOE PCR技术将ND1-1、ND1-2拼接成中间片段ND1-1-2,将ND1-3、ND1-4拼接为ND1-3-4,再经第二次SOE-PCR整合拼接ND1-1-2和ND1-3-4片段,完成NDV起始片段ND1的构建,并连接到pCI载体上,构建pCIND1质粒,最后经酶切PCI-ND1质粒并送测序鉴定目的片段是否构建正确并成功连接到pCI载体上。结果经PCR扩增得到ND1-1、ND1-2、ND1-3、ND1-4共4个分别约1 200bp大小的片段,经第一轮SOE-PCR得到ND1-1-2和ND1-3-4两个2 200bp左右的片段,第二轮SOE-PCR得到4 900bp左右的ND1片段。连接产物PCI-ND1质粒经酶切和测序鉴定片段大小和序列与预期相符。结论成功构建了新城疫病毒基因起始片段(226-4 916bp),为构建新城疫病毒全长基因奠定了基础。

摘要：为建立犬细环病毒(TTCV)的快速检测方法,本研究根据GenBank中登录的TTCV ORF7基因设计合成一对特异性引物,并对反应条件和反应体系进行优化,建立了检测TTCV的SYBR Green I荧光定量PCR方法。结果显示:建立的荧光定量PCR方法 Ct值与标准品模板在5.82×10~9拷贝/μL^5.82×10~3拷贝/μL范围内呈良好的线性关系。该检测方法仅对TTCV检测为阳性,而对狂犬病病毒、犬冠状病毒、犬细小病毒、犬瘟热病毒和犬副流感病毒均无特异扩增;该检测方法灵敏度可达5.82×103拷贝/μL。对27份犬血清样品检测结果显示,建立的荧光定量PCR阳性检测率为11.11%,而普通PCR方法检测阳性率为3.7%。本实验建立了TTCV SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法,对TTCV诊断及致病机制的研究提供了高通量的定量检测方法。

摘要：为建立猪细小病毒7型(PPV7)的快速定量检测方法,本研究根据PPV7(KU563733.1)基因序列设计一对特异性引物,扩增155 bp的PPV7衣壳蛋白基因,构建重组质粒pClon007-PPV7,以其作为标准品建立了PPV7的SYBR GteenⅠ荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法在5.00×10~9拷贝/μL^5.00×10~3拷贝/μL范围内呈良好的线性关系。该方法对猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病毒、乙脑病毒、口蹄疫病毒常见病原的检测均无特异性扩增,仅PPV7出现特异性扩增;该方法检测灵敏度可达5.00×10~1拷贝/μL;批内和批间变异系数均低于1%,具有较高的重复性和稳定性。对临床样品的检测结果显示,所建立的荧光定量PCR阳性检测率为71.88%,比普通PCR法检测的阳性率提高了约4.55%。该研究方法的建立为PPV7提供了一种新的快速定量检测技术。

摘要：建立蓝舌病毒(bluetongue virus,BTV)RT-PCR检测方法,用于2018年云南省库蠓的蓝舌病(BT)流行病学检测。设计2对保守引物,优化RT-PCR方法的退火温度、循环次数、退火时间和延伸时间,并进行灵敏性和特异性评价。采集了昭通市3个县及普洱市澜沧县的BT传播媒介库蠓共25万余只,进行研磨后,用建立的RT-PCR方法检测样本。筛选出1对引物BTVS10-F和BTVS10-R作为蓝舌病毒RT-PCR检测引物,敏感度达到10^(2.5) TCID_(50)/0.1 mL,通过对BTV16型的阳性病毒检测,证实该方法的可行性。