摘要：提取粉尘螨总RNA,根据GenBank中的序列(登录号为AY283281.1)设计并合成引物,RT-PCR扩增Mag 29全长基因,克隆至pCold TF DNA载体,转化至大肠埃希菌(***)JM109,取阳性克隆测序鉴定。将pCold TF-Mag 29质粒转化至BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)验证表达产物,采用生物信息学软件预测Mag 29的结构、理化特性和生物进化关系。RT-PCR产物电泳结果显示,在429 bp处有一条带,与Mag 29基因大小一致,测序鉴定表明质粒构建成功。SDS-PAGE结果显示,表达产物的全细胞、上清和沉淀物中均有相对分子质量(M r)为63 000的蛋白表达,与预测值一致,其中上清中蛋白表达量高于沉淀。生物信息学分析显示,该蛋白是由142个氨基酸组成的M r15 100的分子,二级结构由α螺旋(55.63%)、延伸主链(3.52%)和无规则卷曲(40.85%)组成,是亲水性细胞质蛋白,与热休克蛋白70家族具有较高同源性。

摘要：目的克隆粉尘螨变应原Der f Mal f 6(简称Mal f 6)编码基因并构建其原核表达体系。方法提取粉尘螨总RNA,根据GenBank中的(AY283280.1)序列设计并合成引物,RT-PCR扩增Der f Mal f 6全长基因,克隆至pColdTF DNA载体,转化至*** JM109,取阳性克隆测序;将pCold TF-Mal f 6质粒转化至BL21,IPTG诱导表达,采用SDS-PAGE验证表达产物,采用生物信息学软件预测Mal f 6的理化特性、结构和功能。结果 RT-PCR获得全长为495bp的Mal f 6基因。原核表达后经SDS-PAGE电泳显示其全细胞、上清及沉淀物均有蛋白表达,以上清表达量较高。生物信息学分析该蛋白由164个氨基酸组成,分子质量单位为17.7ku,二级结构由α螺旋(4.88%)、延伸主链(37.8%)和无规则卷曲(57.32%)组成,是亲水性细胞质蛋白,具有肽酰-脯氨酰反式异构酶活性。结论粉尘螨变应原Mal f 6原核表达获得成功,为该变应原的进一步研究及规模生产和应用奠定了基础。

摘要：目的获得粉尘螨变应原第3组分(Der f 3)的编码基因并了解其序列多态性。方法根据GenBank已公布的Der f 3核酸序列设计引物,用RT-PCR扩增获得其编码基因,插入pMD19-T载体,进行序列测定和多态性分析。结果获得粉尘螨变应原Der f 3编码基因为780bp。5株Der f 3基因cDNA克隆的核苷酸序列与参考序列(*** 283291,GenBank No.D63858,GenBank ***312162,GenBank ***312163)相比,有19处cDNA序列发生突变,但有7处突变至少在3个cDNA克隆中序列一致;推导出氨基酸序列后进行比对,有11处氨基酸序列发生变化,有4处与上述7个位点相一致。结论获得了粉尘螨变应原Der f 3编码基因且证明其序列具有多态性,为进一步开展相关研究奠定了基础。