摘要：目的建立一种猪链球菌的快速、简便检测方法。方法根据猪链球菌2型强毒株05ZYH33组氨酸三联体蛋白HtpsC蛋白基因序列设计特异性引物,将HtpsC蛋白基因克隆至原核表达载体pET-30a并转化至大肠杆菌BL21(DE3),经0.2 mmol/L IPTG、15℃条件下诱导表达HtpsC蛋白。经Ni-IDA纯化后免疫新西兰白兔获得抗血清,通过亲和层析纯化制备Anti-HtpsC多克隆抗体。在此基础上,建立检测猪链球菌的斑点酶联免疫吸附检验法(Dot-ELISA),进一步优化了检测条件,并对该方法的特异性和敏感性进行评价。结果通过原核表达成功制备了HtpsC蛋白。Western blot结果显示,制备的Anti-HtpsC多克隆抗体可特异性结合HtpsC蛋白。优化的最佳多抗使用浓度为2.5μg/mL,最佳酶标二抗稀释倍数为1∶3000。特异性试验结果表明,含HtpsC蛋白基因的多种血清型猪链球菌均可呈现清晰的黄褐色斑点,但不含该蛋白基因的9型猪链球菌除外。而其他对照菌株:大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、化脓性链球菌、无乳链球菌和粪肠球菌均无斑点出现。灵敏度试验结果表明,该方法的检测限为1×10^(6)CFU/mL。结论本研究建立的Dot-ELISA方法特异性强,灵敏度良好,可用于检测多种血清型猪链球菌。

摘要：为制备恙虫病东方体SJ_(2)株基因重组抗原和恙虫病血清学诊断备选抗原,根据恙虫病东方体56 kDa外膜蛋白基因序列设计特异性引物,经PCR扩增东方体SJ_(2)株56 kDa型蛋白羧基端部分基因,序列测定并用软件Bioedit与我国主要东方体流行株56kDa蛋白进行氨基酸序列比对分析。然后克隆至载体pET-28a并在BL21菌体中诱导表达,通过His镍柱纯化目的蛋白,SDS-PAGE和Western-blot鉴定分析。结果显示,成功扩增出恙虫病东方体SJ_(2)株56 kDa蛋白708 bp基因片段,氨基酸序列比对显示,该截短蛋白含2个保守区和1个可变区。经IPTG诱导表达后,蛋白电泳在27 kDa处出现明显目标条带。Western-blot结果显示,该蛋白与恙虫病病人血清有特异性免疫反应,与正常人血清不反应。结果表明,诱导表达的重组56 kDa蛋白具有良好的免疫原性,可能备选为恙虫病诊断抗原用于恙虫病血清学检测。