摘要：背景:生长分化因子5在软骨、四肢和关节的发育、形成中起着重要作用,是目前最常应用的研究早期关节发育的标志分子。克隆人生长分化因子5基因可为软骨、关节缺损的修复奠定研究基础。目的:利用基因工程技术在大肠杆菌中表达人生长分化因子5成熟肽,探讨重组蛋白的体内诱导活性。设计、时间及地点:基因水平观察实验,于2006-01/06在南方医科大学分析测试中心完成。材料:人流产胚胎膝关节区软骨组织取自解放军广州军区总医院妇产科,标本获取征得家属同意。10只KM小鼠购自南方医科大学实验动物中心,雌雄各半,体质量18～22g,6～8周龄。方法:通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从人胚胎软骨组织克隆生长分化因子5完整成熟肽基因,将所得基因片段插入pET22b(+)载体构建重组原核表达载体pET22b(+)-GDF5,重组质粒转化大肠杆菌BL-21进行IPTG诱导表达。凝胶介质镍离子螯合法纯化目的蛋白,植入小鼠后肢股部肌袋内常规苏木精-伊红染色进行生物学活性鉴定。主要观察指标:琼脂糖凝胶电泳观察目的基因表达条带,测序观察目的基因序列,SDS-PAGE电泳观察目的蛋白表达条带,组织学观察生长分化因子5诱导活性。结果:RT-PCR产物长约350bp,阳性克隆质粒经双酶切可切出约350bp的片段,测序表明与Genbank中的序列完全一致。SDS-PAGE电泳显示重组子转化菌在相对分子质量14100位置处出现特异外源蛋白表达带,和成熟肽相对分子质量13600接近。纯化后体内植入实验组织切片显示,大量的间充质干细胞聚集和增生,并分化成为成软骨细胞,分泌软骨基质并埋入其中变为软骨细胞。结论:通过RT-PCR法从人胚胎软骨组织中成功克隆出人生长分化因子5完整成熟肽基因,可在大肠杆菌中得到高效表达,经纯化后在动物体内具有成软骨诱导活性。

摘要：目的:克隆西藏小型猪CYP3A基因并与人及其它小型猪品种进行序列比对分析。方法:根据Genebank数据库设计引物,取西藏小型猪新鲜肝脏组织,Trizol法提取肝脏总RNA,应用RT-PCR反转获得肝脏cDNA。分别扩增基因CYP3A46、CYP3A22、CYP3A29及CYP3A39,PCR片段回收后分别连接pMD-18T载体,获得重组质粒pT-CYP3A,阳性重组克隆送测序。采用NCBI Blast及vector NTI软件进行序列比对分析。结果:CYP3A46、CYP3A22、CYP3A29及CYP3A39基因编码序列全长1512 bp,编码503个氨基酸,与人CYP3A4相同。其中CYP3A22和CYP3A39与NCBI记录巴马小型猪序列相同;CYP3A46与巴马小型猪CYP3A46(NM_001134824.1)有6个位点碱基不同。CYP3A29与巴马小型猪CYP3A46(EU918131.1)亦有6个位点碱基不同。对来自2个母本后代猪的基因经过PCR扩增后测序发现CYP3A46、CYP3A29序列完全一致。结论:成功克隆西藏小型猪CYP3A的4个基因,其中CYP3A46与人CYP3A4的序列相似性最高。所得CYP3A46与CYP3A29序列可能为西藏小型猪独有。

摘要：探讨利用微信公众平台进行辅助教学的可行性,将课件、重点难点解析、知识点总结等上传微信公众平台,实现传统课堂教学与线上网络教学有机结合,以提高学生学习兴趣和教学质量。

摘要：目的:建立西藏小型猪CYP3A基因梯度PCR扩增方法。方法:以西藏小型猪肝脏总cDNA为模板,基于CYP3A46基因引物,对CYP3A46进行梯度PCR扩增(设计温度梯度55-65℃)。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,获得特异性好的最佳退火温度。结果:各退火温度均能特异的扩增出1500bp左右的目的条带。结论:本反应体系及各温度梯度均可特异性扩增西藏小型猪CYP3A46基因,为进一步克隆表达奠定了基础。