摘要：口蹄疫病毒3C蛋白酶在病毒的致病机理、聚蛋白前体的加工和RNA的复制上起着很重要的作用,是当前抗病毒研究的一个重要靶点。本研究从AsiaⅠ型FMDV适应细胞毒中提取RNA,用RT-PCR技术扩增3C基因,首先克隆到pGEM-T载体,再亚克隆到杆状病毒转移载体pMelBacB中,构建出重组转移载体pMel-3C。最后将含有目的基因的转移载体与线性化的杆状病毒DNA共转染Sf9细胞,通过噬斑筛选和PCR鉴定,获得了重组杆状病毒。重组病毒经扩增后以10个MOI感染Sf9细胞,接种病毒72h后收获细胞,样品经SDS-PAGE和Westernblot证实3C蛋白获得表达,分子量约23kDa,与预测蛋白大小一致,且能被FMDV感染阳性血清所识别。本研究为空衣壳的体外组装及新型抗病毒药物设计的研究奠定了基础。

摘要：口蹄疫表位疫苗既不存在病毒复制风险,又能同时展示多个变异株的优势表位,是具有巨大发展潜力的新型疫苗。本文将从口蹄疫病毒的抗原表位,表位疫苗的设计和优化以及表位疫苗的应用等方面进行综述,为合理设计和研发有效的口蹄疫表位疫苗提供参考。

摘要：构建可以稳定敲降Atg7基因的重组慢病毒载体,并使用该载体构建稳定敲降Atg7基因的PK-15细胞系。首先根据GeneBank数据库中Atg7基因的序列设计特异性的干扰序列并构建重组慢病毒载体,包装慢病毒后感染PK-15细胞,通过药物筛选的方式获得稳定敲降Atg7基因的细胞系,最后通过实时荧光定量PCR和Western-blot试验检验细胞系的敲降效果。重组质粒的双酶切结果和测序结果证实,重组载体序列与最初设计序列完全一致;实时荧光定量PCR和Western-blot试验的结果均显示重组质粒pLKO.1-Atg7-shRNA-Puro能够抑制PK-15细胞中Atg7的表达和自噬的发生。上述结果表明,本研究成功构建了重组慢病毒载体pLKO.1-Atg7-shRNA-Puro和稳定敲降Atg7基因的PK-15细胞系,为后续研究Atg7基因的生物学功能以及细胞自噬在宿主抗病毒感染中的重要作用奠定了基础。

摘要：【目的】研制猪口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)A型多表位蛋白疫苗,为猪FMDV A型的防控提供安全有效的疫苗。【方法】根据前期试验结果及国内外FMDVA型流行病学信息,设计并合成了3种多表位免疫原基因A10、IA10和FA10。在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,表达蛋白纯化复性后,制苗免疫猪。分别于免疫前和免疫后14和28d采血分离血清,用液相阻断ELISA(LPB-ELISA)方法检测血清IgG抗体滴度。免疫28d后用FMDV强毒攻毒,以评估免疫保护效果。【结果】SDS-PAGE和Western blotting结果证实A10、IA10和FA10三种蛋白均获得表达,分子量分别为35、57和64 kDa,与预测蛋白大小一致,且能被FMDV感染阳性血清所识别。LPB-ELISA结果表明,A10+201免疫组IgG滴度低于灭活疫苗组,但高于其他免疫组。攻毒后A10+201免疫组和灭活疫苗免疫组全部猪(5/5)获得保护,IA10+201和FA10+201免疫组80%(4/5)猪保护,A10和FA10免疫组只有20%(1/5)猪保护,而PBS+201组所有猪均未保护。【结论】A10+201免疫保护效果较好,可作为候选疫苗进行进一步评价。

摘要：为了解甘肃省部分PRRSV流行株的分子生物学特征和遗传演化规律,对来自甘肃武威一猪场的疑似PRRS感染病料通过细胞培养进行PRRSV分离。该病料细胞培养物可以引起Marc-145细胞发生明显的细胞病变,PRRSV特异性引物RT-PCR扩增结果显示该病料组织为PRRSV阳性,IFA实验显示接种分离病毒株的Marc-145细胞可以与PRRSV N蛋白抗体反应,出现特异性荧光,将其命名为GSWW2018。设计引物对该毒株全基因组进行分段扩增,克隆测序后拼接得到全长序列。采用DNAstar软件分析其与48个参考毒株核苷酸及氨基酸的同源性,使用MEGA7.0软件绘制系统遗传进化树,并利用Simplot软件分析其重组事件。结果显示GSWW2018全长14 997 bp,其Nsp2蛋白存在与NADC30相似的"111+1+19"的131个氨基酸的不连续的缺失。Nsp2基因和ORF5基因系统进化树分析结果表明其属于类NADC30亚群。重组结果表明GSWW2018可能由HP-PRRSV与NADC30重组而来。本研究表明甘肃省已出现类NADC30毒株,需要进一步加强监测。

摘要：用设计的特异引物,扩增得到了N-端带有6×His编码序列的口蹄疫病毒完整3ABC基因序列,并将其亚克隆入带有蜂毒溶血肽序列的穿梭质粒pMelBac-B中,构建了重组质粒pMel-3ABC。将该重组质粒与杆状病毒骨架DNABac-N-BlueTM共转染Sf9昆虫细胞,通过噬斑筛选和PCR鉴定,获得了含有目的基因的重组杆状病毒。重组病毒感染Sf9昆虫细胞,采用通过SDS-PAGE和Western blot检测,证明目的基因在昆虫细胞中得到了正确的表达,表达产物分泌至细胞培养上清中,并具有良好的生物活性。表达的目的蛋白经过镍柱亲和层析法纯化后,用间接ELISA方法检测与口蹄疫病毒感染动物血清的反应性,证明表达目的蛋白与感染动物血清有很好的反应性而与正常动物以及免疫动物血清不发生反应。该研究为建立一种更加敏感和特异的口蹄疫病毒感染动物与疫苗免疫动物的鉴别诊断方法奠定了基础。

摘要：根据测定的口蹄疫病毒(FMDV)2C基因序列,设计了一对特异性的表达引物,用于扩增2C基因5′-端174bp和3′-端279 bp连接片段,该区含有较丰富的B细胞表位编码序列。扩增片段通过NcoⅠ和SalⅠ酶切位点插入表达载体pET-30a。序列测定表明,目的基因片段连接正确,按正确的读码框插入表达载体中。重组表达质粒转化BL21(DE3)pLys,经IPTG诱导表达目的蛋白。表达产物经SDS-PAGE和Western Blotting检测表明,2C基因主要表位区成功地在大肠杆菌表达,表达产物为约23 ku的融合蛋白,能够与FMDV感染动物血清发生特异性反应,而不与健康和灭活疫苗免疫动物血清反应。该研究为建立鉴别FMDV自然感染动物和灭活疫苗免疫动物的酶联免疫转印(EITB)方法提供了所需的材料。

摘要：主要探讨了T细胞免疫原TI对口蹄疫疫苗的免疫增强作用。设计并原核表达产生了一种包含口蹄疫病毒VP1,VP4,3A和3D蛋白上多个T细胞表位与两个通用T细胞表位的T细胞免疫原,命名为TI;同时表达了O和Asia 1两个型口蹄疫病毒VP1蛋白的串联编码基因,表达产物命名为OA-VP1。将上述T细胞免疫原分别与OA-VP1和口蹄疫灭活疫苗按不同剂量组合免疫小鼠,于免疫后不同时间测定各组小鼠的体液与细胞免疫应答情况。采用微量中和试验检测小鼠O型和Asia1型中和抗体,采用流式细胞检测技术和测定γ-干扰素的水平来分析不同免疫组小鼠细胞免疫的水平。结果显示,与灭活疫苗或OA-VP1单独免疫组相比,添加TI抗原后灭活疫苗(P<0.01)和OA-VP1免疫组(P<0.05)小鼠均能产生高水平的特异性中和抗体;且CD4+T细胞数量显著增多I,FN-γ产生水平显著升高(P<0.01)。说明TI抗原具有很好的诱导特异性体液与细胞免疫应答的作用,是一种很好的免疫增效剂,可作为口蹄疫蛋白亚单位疫苗和灭活疫苗中的一种有效成分,以提高疫苗的免疫效果。

摘要：【目的】测定一株A型口蹄疫流行毒株的全基因组序列,并构建其全长感染性克隆。【方法】参照已公布的A型口蹄疫病毒序列设计引物,将分离的口蹄疫病毒株A/Sea-97/CHA/2014全基因组分为4个重叠的片段进行RT-PCR扩增,并对其进行序列测定与分析。利用酶切连接法将4个基因片段依次克隆至p Blue Script SKhdv载体中,构建该流行毒株的全长c DNA克隆p QAHN。pQAHN经NotⅠ线性化后转染表达T7 RNA聚合酶的BSR/T7细胞,拯救病毒。【结果】口蹄疫病毒全基因组序列测定结果表明该毒株基因组全长8 171 bp[不包括poly(C)区段和poly(A)尾巴],开放阅读框为6 996 bp,编码2 332个氨基酸,5′和3′非编码区分别为1 091 bp和95 bp。VP1系统发生树分析表明该毒株与A/GDMM/CHA/2013毒株亲缘关系最近,相似性为99.1%。线化全长质粒转染BSR/T7细胞68 h后可观察到典型的细胞病变。拯救病毒的间接免疫荧光、RT-PCR和序列测定结果表明成功拯救出了具有感染性的FMDV。拯救病毒与亲本病毒的噬斑表型及生长曲线试验表明二者具有相似的生长表型和增殖能力。【结论】该研究为我国口蹄疫病原生态分布、分子流行病学调查以及A型FMD新型疫苗的研究提供了有益的材料。

摘要：为了探索更有效的A型口蹄疫(FMD)表位疫苗,根据已鉴定的A型口蹄疫病毒(FMDV)主要抗原位点,结合基因序列比对分析,选择了A型FMDV流行毒株的主要抗原位点区进行表位蛋白分子的设计表达。所用表位序列包括A/QH/CHA/2013的VP2 70~81位、118~140位,VP1 G-H环131~157位、C末端188~212位,A/WH/CHA/09 VP1 43~48位、VP3 55~72位,以及非结构蛋白3A中的T细胞表位和通用性T细胞表位,构建免疫原蛋白分子命名为ANX2和ANX3,其中ANX2采用了表位序列反向串联的方式进行设计,用大肠杆菌表达免疫原基因,纯化表位蛋白免疫小鼠和猪,分析特异性体液免疫和细胞免疫应答水平,并对免疫猪进行了攻毒保护试验,评价表位疫苗的保护效果。结果显示,ANX2、ANX3重组蛋白以包涵体表达为主,蛋白大小约为41 ku和39 ku,均能与A型FMDV阳性血清发生特异性反应;免疫小鼠和猪后都能产生抗A型FMDV特异性抗体;用表位蛋白刺激免疫小鼠脾淋巴细胞,细胞因子IFN-γ和IL-4均有明显的升高;攻毒后对猪有一定的保护作用,ANX2的免疫效果略优于ANX3,证明表位序列反向串联更有利于抗原表位的展示,从而增强其免疫效果。本研究为A型FMDV表位疫苗的研究积累了经验。