摘要：为了探索宿主蛋白Rab11a在感染牛病毒性腹泻病毒(BVDV)后,对细胞增殖的影响。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Rab11a基因稳定敲除的MDBK细胞株,设计靶向Rab11a基因的向导RNA表达载体,采用Western blot检测Rab11a基因敲除后的蛋白表达情况;使用实时荧光定量qPCR、免疫荧光染色试验、Reed-Muench法等技术检测BVDV感染Rab11a KO细胞后病毒RNA水平、双链RNA(dsRNA)积累水平、病毒滴度及致细胞病变(CPE)情况等。Western blot检测结果显示,成功构建出Rab11a基因敲除的细胞Rab11a KO;Rab11a基因敲除显著抑制BVDV 5'UTR mRNA和dsRNA水平的积累,感染36 h后,Scramble细胞明显有大量细胞病变,出现皱缩、碎裂、形成空泡后脱落等现象,Rab11a KO细胞的CPE现象明显低于Scramble细胞;在BVDV感染细胞12 h后,与Scramble细胞相比,Rab11a KO细胞的病毒滴度显著性降低,结果证明了敲除MDBK细胞的Rab11a基因对BVDV在胞内复制起到抑制作用。本研究结果为了解宿主蛋白Rab11a与BVDV的相互作用,以及Rab11a对病毒的复制增殖的作用提供了新的科学依据。

摘要：[背景]牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)是致犊牛腹泻的重要病原之一,而目前BVDV与宿主因子互作机理研究较少,成为限制BVDV防控的重要原因。[目的]探明囊泡相关膜蛋白A(vesicle-associated membrane protein A,VAPA)对BVDV复制的影响。[方法]根据GenBank中VAPA基因,使用Benchling和CHOPCHOP等平台设计靶向VAPA的向导RNA(small guide RNA,sgRNA),融合后克隆至慢病毒lentiCRISPR v2载体中,包装慢病毒后感染牛肾细胞(Madin-Darby bovine kidney,MDBK),使用嘌呤霉素连续筛选5代,使用Western Blot检测VAPA蛋白敲除(knockout,KO)情况;BVDV感染VAPA KO细胞不同时间后,收集细胞提取总RNA,并将等质量的RNA反转录成cDNA,使用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)和免疫荧光分析(immunofluorescence assay,IFA)分别检测BVDV 5’-非翻译区(untranslated region,UTR)mRNA水平和双链RNA(double strand RNA,dsRNA)积累水平,于BVDV感染后不同时间观察致细胞病变(cytopathic effect,CPE)情况,并收集子代病毒液,使用Reed-Muench法计算子代病毒滴度变化。接种等量VAPAKO和乱码序列对照scramble细胞后不同时间进行活细胞计数,检测VAPA KO是否影响细胞活性。[结果]慢病毒感染后使用嘌呤霉素筛选,Western Blot检测VAPA蛋白明显降低,成功获得VAPAKO细胞;与对照scramble细胞相比,BVDV感染VAPAKO细胞后5’-UTR mRNA水平和dsRNA积累量均显著性降低,BVDV感染造成的CPE明显推迟并减轻,子代病毒滴度在12 h和36 h显著下降,在48 h极显著下降;与scramble细胞相比,VAPA KO细胞活性未受影响。[结论]VAPAKO后显著性抑制BVDV复制,为BVDV防控新技术的建立提供重要靶标。

摘要：旨在探明信号肽酶复合体亚基1(signal peptidase complex subunit 1,SPCS1)影响牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)复制的作用。使用Benchling和CHOPCHOP等平台设计靶向SPCS1基因的sgRNA,克隆至慢病毒载体lentiCRISPR v2,连同包装质粒pSPAX2和pMD2.G转染至人胚肾细胞HEK-293T中,包装慢病毒并感染MDBK细胞,用嘌呤霉素筛选5代后获得敲低SPCS1蛋白后稳定表达的细胞,用Western blot检测SPCS1蛋白表达的情况;使用荧光定量PCR和免疫荧光分析检测BVDV感染SPCS1蛋白敲低细胞不同时间后5′非翻译区(untranslated region,UTR)mRNA的水平和双链RNA(double-stranded,dsRNA)积累,利用倒置显微镜观察BVDV致细胞病变(cytopathic effect,CPE)情况,根据Reed-Muench方法测定病毒滴度变化情况。结果:Western blot检测SPCS1蛋白表达量明显下降,成功构建SPCS1敲低(knockdown,KD)细胞;BVDV感染SPCS1 KD细胞后与对照Scramble相比,BVDV 5′UTR mRNA水平和dsRNA量均显著性降低(P<0.01),CPE现象推迟并减弱,子代病毒滴度显著性下降(P<0.01),最高降低95.8%。SPCS1敲低后显著性影响BVDV复制,为BVDV防控新技术的建立提供理论依据。

摘要：为了获得牛自噬相关基因10(ATG10)蛋白,试验参照GenBank中牛ATG10基因设计引物,PCR扩增ATG10基因,与pET-N-His-TEV载体连接,测序鉴定正确后用IPTG诱导ATG10蛋白表达,利用Ni-TED琼脂糖树脂进行蛋白纯化,Western-blot鉴定ATG10蛋白表达情况,通过生物信息学在线软件对ATG10蛋白进行分析,获得其相应的理化性质及参数。结果表明:克隆得到的ATG10基因序列长度约为705 bp,测序鉴定正确后得到pET-N-His-TEV-ATG10原核表达载体,IPTG成功诱导表达了ATG10蛋白,分子量为28 ku;ATG10蛋白与兔抗ATG10抗体特异性结合;ATG10蛋白是一种较为稳定的、含38个潜在的磷酸化位点、无跨膜区及信号肽的亲水性蛋白,二级结构中无规则卷曲占比44.44%,与ATG5、ATG12、ATG16L1、ATG3等多个自噬相关蛋白相互作用。说明试验成功构建出pET-N-His-TEV-ATG10原核表达载体,并获得ATG10蛋白。

摘要：为了快速准确地进行设计阶段的人机产品创新,开发了E/HOQ/TRIZ集成模型并描述了具体步骤,提出了基于人体工程学(E)的人机用户需求三维分类的需求获取方式;通过质量屋(HOQ)确立人机设计关键问题与关键人机设计区域;利用发明问题解决理论(TRIZ)分析人机设计关键问题中的冲突类型,借助TRIZ发明原理消除冲突。E/HOQ/TRIZ集成模型有效弥补了单一设计理论与方法的局限性,并发挥三种理论与方法的优势,实现人机产品创新设计。通过人机洗浴设施创新设计,论证了所提出E/HOQ/TRIZ集成模型与方法的可行性。

摘要：为建立基于CRISPR/Cas9技术的基因敲除细胞文库,本研究采用慢病毒转导构建稳定表达Cas9蛋白的BHK-21-Cas9单克隆细胞系。将pMD2.G、pSPAX2和lentiCas9-Blast共转染HEK-293T细胞包装慢病毒,感染BHK-21细胞后经Blasticidin S进行阳性筛选,筛选5代后通过有限稀释法培养Cas9单克隆细胞,利用Western blot检测Cas9蛋白的表达。为获得Cas9活性强的BHK-21-Cas9单克隆细胞系,根据紧密连接蛋白(OCLN)基因序列,设计针对OCLN基因的sgRNAs,构建lentiGuide-Puro-OCLN sgRNA重组质粒,测序鉴定后将lentiGuide-Puro-OCLN sgRNA重组载体转染BHK-21-Cas9单克隆细胞系。使用嘌呤霉素进行阳性细胞筛选,经过Western blot检测OCLN蛋白的表达。Western blot检测Cas9蛋白结果显示,共获得了17株BHK-21-Cas9单克隆细胞系;测序结果显示,lentiGuide-Puro-OCLN sgRNA载体构建成功,通过Western blot鉴定,有2株Cas9编辑效果好、具有高敲除效率的BHK-21单克隆细胞系。结果表明,本研究构建了稳定表达Cas9蛋白的BHK-21-Cas9单克隆细胞系,可以用于CRISPR/Cas9敲除文库的转导,建立基因敲除细胞文库,为筛选影响病毒感染和复制的功能基因提供了科学依据。

摘要：目的研究基于Kano模型与用户需求分类的就诊服务系统的设计原则与设计路径。方法通过服务蓝图等调研方法获取用户在就诊体验过程中的原始需求,利用Kano模型将原始用户需求进行分类,借助四象限散点模型分析识别需求的重要度与急需度,依据需求优先级实现就诊服务系统设计创新。结果以就诊服务系统设计为例,获得用户在体验过程中的需求原始描述,并对需求重要度进行优先级排序,提出具体的设计策略及原则,从方便预约、就诊时位置导航、建立个人病历系统和服药便利4项用户需求出发,形成一款针对就诊服务系统的APP设计。结论利用Kano模型的用户需求分类及重要度识别方法进行缺口分析,探索出针对就诊服务系统的技术路径和设计原则,为后续相似研究提供一定的方法和参考。

摘要：文章从矿业开发影响和地质环境脆弱性相互作用的角度出发,提出了矿山地质环境风险评价的定义及方法。将大同市作为评价对象,建立了矿业开发影响力和地质环境脆弱性评价指标体系,利用层次分析法进行指标权重分析,进而通过模糊综合评判数学模型进行计算和对比;最终将大同市划分为矿山地质环境高风险区、中风险区和低风险区。并根据评价分区结果,提出了风险防控建议。

摘要：目的在现有产品的基础上对产品进行需求创新。方法将TRIZ理论的8个技术进化模式和Kano模型需求划分相结合,针对现有产品的需求创新概念产生流程。结果以智能手表设计为例,分析智能手表的需求进化方向,得出智能手表的潜在用户需求,形成一款具有以社交属性为主的智能手表概念。结论产品需求创新概念产生流程可以满足在现有产品基础上进行需求创新的目的,为公司或企业提供一定的方法依据。

摘要：为建立快速检测抗FMDV转基因猪中O型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)的荧光定量PCR方法,本试验选择FMDV结构蛋白基因3 D的核苷酸序列设计特异性引物,经过RNA抽提、反转录成cDNA、PCR扩增,扩增出了大小为180bp的基因片段。将回收的目的片段与pMD18-T克隆载体连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。提取的质粒经PCR、酶切和测序鉴定,证实为FMDV的阳性重组质粒。将验证正确的重组质粒10倍梯度稀释后作模板,进行荧光定量PCR试验,建立FMDV 3 D基因的标准曲线及其回归方程,并确定扩增的最佳退火温度。试验结果显示标准曲线的回归方程为Y=-3.727X+32.04,回归系数R2=0.980,熔解曲线为单一峰。建立的荧光定量PCR方法的灵敏度为1.2×101拷贝/μL,只与FMDV反应。结果表明,建立的荧光定量PCR方法具有特异性强、灵敏度高等特点,为检测FMDV在动物组织细胞中的含量提供了技术方法。