摘要：目的基于SYBR Green I染料建立沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌的多重荧光定量PCR检测方法。方法针对沙门菌invA基因、志贺菌ipaH基因和virA基因、金黄色葡萄球菌nuc基因和femA基因片段设计引物,根据Tm值的差异分析确定荧光定量PCR扩增的靶基因和特异性引物,通过优化PCR反应体系,建立了用SYBR GreenⅠ多重荧光定量PCR熔解曲线来检测多种致病菌的方法。结果该方法检测的菌液灵敏度分别是沙门菌168 CFU/ml,志贺菌136CFU/ml,金黄色葡萄球菌1240CFU/ml,特异性强,整个过程只需要2h。结论该方法能快速、灵敏、特异检出沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌。

摘要：目的:根据构巢曲霉(Aspergillus nidulans)3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)基因特异位点设计并合成Taqman探针及引物,建立构巢曲霉实时荧光PCR检测方法。方法:应用lasergene7.1软件对构巢曲霉与13种常见曲霉主要包括黑曲霉(***)、烟曲霉(***)、杂色曲霉(***)、土曲霉(***)、黄曲霉(***)、温特曲霉(***)、寄生曲霉(***)、泡盛曲霉(***)、米曲霉(***)、棒曲霉(***)、赤曲霉(***)、亮白曲霉(***)及赭曲霉(***)进行GAPDH基因序列比对分析,在特异位点设计引物和探针,建立构巢曲霉实时荧光PCR检测方法,并对该方法进行特异性及敏感性分析。结果:用曲霉属22种41株不同曲霉及其他属的12株病原真菌验证实验表明,所建立的荧光PCR方法特异性强;检测灵敏度可达4.03×10-12μg/ml的模板DNA。结论:应用实时荧光PCR技术能够有效检测构巢曲霉,该方法具有特异、灵敏、快速等特点,可在实际工作中应用。

摘要：目的分析市售不同厂家DNA聚合酶中的宿主细胞核酸残留。方法根据*** 16S rRNA基因序列设计特异引物及探针,建立基于Taqman探针技术的Real-time PCR检测方法,检测基因工程制品中***的核酸残留。结果建立的Real-time PCR法检测市售不同厂家的DNA聚合酶中均有宿主细胞***核酸残留,但不同来源的DNA聚合酶其宿主细胞核酸残留量不同。结论应用PCR方法检测基因工程产品,尤其是***制备的生物制品时,应注意DNA聚合酶中核酸残留对检测结果的影响;应用Real time PCR法定量检测时,建议将Ct值控制在30以内,以减小DNA聚合酶背景残留物的影响。

摘要：目的建立黑曲霉实时荧光PCR检测方法。方法对6种主要病原曲霉(黑曲霉、烟曲霉、杂色曲霉、构巢曲霉、土曲霉及黄曲霉)的GAPDH基因序列进行比对分析,选择黑曲霉特异位点设计引物和探针,对黑曲霉进行实时荧光PCR扩增,并检测该方法的灵敏度及特异性。结果该方法可检出2.78×10-10μg/ml的黑曲霉基因组DNA;对亲源关系较近的11株不同种曲霉及4株其他属临床常见的病原真菌进行实时荧光PCR检测,未发现有交叉反应。结论已建立了灵敏度高、特异性好的快速检测黑曲霉的实时荧光PCR方法。

摘要：为了建立大肠杆菌O157:H7微孔板固相捕获呈色探针快速检测方法,试验根据GenBank网站公布的大肠杆菌O157:H7血清型基因序列设计1对特异性引物和探针,进行聚合酶链式反应、核酸杂交、酶联显色,测定吸光度值,并对此快速检测方法的特异性和敏感性进行研究。结果表明:大肠杆菌O157:H7吸光度值为2.214,敏感性试验最低检测限为每25 mL菌液中有1 cfu。

摘要：目的建立一种快速、特异、灵敏的人粪便中华支睾吸虫虫卵检测方法,并对方法进行评价,为快速、准确、有效诊断人是否患有华支睾吸虫病提供依据。方法以华支睾吸虫细胞色素c氧化酶亚基1基因为靶位点,用Primer Express3.0软件设计引物,经Blast软件对相似序列搜索后,筛选出一套最优与常见寄生虫无交叉反应的引物;分别用猫后睾吸虫、粪类圆线虫、日本血吸虫、细粒棘球虫、卫氏并殖吸虫等可感染人类、虫卵形态易混淆、种属关系较近的寄生虫的DNA进行特异性实验;将含有目的片段的阳性质粒梯度稀释后进行PCR扩增,确定检测方法的灵敏性;利用建立的方法对吉林省白城市周边人粪样品进行检测,验证方法的可行性。结果利用细胞色素c氧化酶亚基1基因设计的引物仅对华支睾吸虫(或虫卵)DNA有扩增条带,而其他对照以及阴性对照均未有明显扩增条带,对华支睾吸虫虫卵阳性质粒DNA检测敏感性可达到2.47×10^(2)copies/μl,建立的方法能够对实际粪便中的华支睾吸虫虫卵进行有效扩增,与传统图片镜检法比较二者检测结果一致。结论PCR方法特异性强,灵敏度高,可以快速、准确检测人粪便中的华支睾吸虫虫卵,可以为华支睾吸虫病的快速诊断提供技术支持。

摘要：目的:建立一种快速、特异、灵敏的幽门螺杆菌检测方法,并对方法进行评价,为快速、准确、有效检测幽门螺杆菌方法的建立提供依据。方法:以尿素酶基因序列为靶位点,用Primer Express 3.0软件设计引物及探针,经Blast软件对相似序列搜索后,筛选出一套最优与常见致病菌无交叉反应的引物;分别用食品中常见致病菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、沙门菌和空肠弯曲菌DNA进行特异性实验;将计数过的幽门螺杆菌菌悬液与牛奶样品混合液,梯度稀释后分别提取DNA进行荧光PCR扩增,确定检测方法的灵敏度;对人工污染幽门螺杆菌的生奶及生肉样品进行检测验证方法的可行性。结果:利用尿素酶基因设计的引物及探针仅对幽门螺杆菌有扩增曲线,而其他对照以及阴性对照均未有明显扩增曲线;能够对生奶及生肉中污染的幽门螺杆菌进行有效扩增;设计的引物对幽门螺杆菌的检测敏感性可达到***-1,检测可以在4d内完成。结论:荧光PCR方法特异性强,灵敏度高,可以快速、准确检测食品中污染的幽门螺杆菌。

摘要：目的:建立一种快速、特异、灵敏的荞麦成分检测方法。方法:针对荞麦内转录间隔区ITS(internal transcribed spacer)和5.8SrRNA基因序列设计一对PCR引物及探针,建立实时荧光PCR检测方法;以同源性(27个荞麦属相关物种)及非同源性(食品中常见的栽培型植物)参考植物物种作特异性检测;以50mg/kg小麦DNA作为稀释液对荞麦DNA进行梯度稀释,做灵敏度检测。结果:该方法能够有效对荞麦成分进行快速检测,具有较强的特异性,灵敏度较高(可达0.1μg/kg)并且小麦成分的存在对荞麦灵敏度检测没有影响。结论:该方法特异性强,灵敏度高,可以快速、准确检测食品中含有的痕量荞麦成分。

摘要：目的:根据烟曲霉Mto1基因特异位点设计并合成探针及引物,建立应用实时荧光PCR检测烟曲霉的方法。方法:通过对多种病原曲霉Mto1基因序列的比对分析,在烟曲霉特异位点设计引物及探针,并对其进行特异性及敏感性进行验证。结果:通过对曲霉属26株不同曲霉菌及其他属的6株不同病原真菌的特异性验证未发现有交叉反应,敏感性实验显示应用该方法可检出1.08×10-6μg/ml的模板DNA。结论:实验建立了应用实时荧光PCR技术检测烟曲霉的方法,该方法具有特异、灵敏、快速等特点并能有效避免普通PCR中的样品间交叉污染问题。

摘要：目的建立蜜蜂黑蜂王台病毒(Black queen cell virus,BQCV)的RT-PCR快速检测方法。方法根据BQCV全基因组序列,在其3′端1 000 bp的区域内设计1对特异性PCR引物,从受BQCV感染的蜜蜂的蛹样品中提取总RNA,进行RT-PCR,并对该法的特异性、敏感性及重复性进行验证。结果从BQCV全基因组序列中可扩增出700 bp的基因条带。该方法可扩增0.1 ng的BQCV DNA;仅能在BQCV中扩增出700 bp的目的基因条带,在蜜蜂急性麻痹病病毒、残翼病病毒、蜜蜂囊状幼虫病病毒中均未扩增出目的基因条带;对相同样品进行多次检测,均在700 bp处出现目的条带。结论已成功建立BQCV RT-PCR快速检测方法,该方法特异性强,敏感性高,重复性好,可用于黑蜂王台病的快速诊断和混合感染的鉴别诊断。