摘要：为建立一种灵敏且快速检测猫泛白细胞减少症病毒(FPV)的分子检测方法,本研究采用纳米颗粒与普通PCR技术相结合,通过使用Oligo 7设计FPV的特异性引物,建立FPV Nano-PCR分子检测方法,并与普通PCR方法进行对比分析。结果显示,所建立的Nano-PCR的敏感度是普通PCR的10倍(10 fg/μL);特异性试验表明,Nano-PCR只检测猫泛白细胞减少症病毒时呈阳性反应,而检测猫杯状病毒(FCV)、猫疱疹病毒(FHV)以及F81细胞cDNA/DNA时呈阴性反应。利用两种方法对采集的26份临床病料进行平行检测,发现Nano-PCR与普通PCR阳性率分别为53.84%和42.31%。上述结果表明,所建方法具有敏感性好、特异强、简捷快速等优点,可应用于临床样品的快速检测和鉴定,为猫泛白细胞减少症的早期诊断和防控提供了一定技术保障。

摘要：为了同时检测临床上牛常见的三种呼吸道重要病原体,本研究针对牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)和牛支原体(MB)保守基因进行引物设计,并成功构建标准阳性质粒。使用纳米金颗粒将普通PCR方法优化,建立了三重Nano-PCR检测方法。结果显示,三重Nano-PCR检测方法可同时检测出BVDV、IBRV和MB的阳性质粒(1μL)最低检测分别为1 fg、100 ag、10 fg,灵敏度分别为常规PCR的10、10、100倍。临床结果显示,30份采集于临床呼吸道病牛样品中,BVDV、IBRV和MB的Nano-PCR的检测阳性率分别为33.33%、36.67%、33.33%,而普通PCR的检测阳性率分别为26.67%、30%、20%,提示BVDV和IBRV混合感染最多,阳性率可达26.67%。三重Nano-PCR方法特异性良好,检测其他牛呼吸道相关病原体BCV、BPIV3和BRV时结果均呈阴性。本研究建立的快速灵敏且特异良好的三重Nano-PCR检测方法可广泛应用于临床诊断和流行病学筛查。

摘要：为建立牛病毒性腹泻病毒(BVDV)一步法微滴数字PCR(RT-ddPCR)方法,本研究在一步法实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测方法的基础上,设计BVDV的特异性引物和探针,对RT-ddPCR试验中的反转录酶、退火温度、引物和探针浓度以及检测方法的反应条件进行优化。同时对其特异性、敏感性、重复性进行评估。结果显示,建立的RT-ddPCR方法最佳反转录体系为商品化一步法数字PCR试剂盒配套试剂、引物和探针终浓度分别为900 nmol/L和250 nmol/L,最佳退火温度为57℃;用本方法检测常见疫病病毒时结果呈阴性;本方法最低检测限为3.2 copies/μL,重复性好,且变异系数小于5%。采用RT-ddPCR和RT-qPCR对24份牛源拭子样品进行检测,检测结果显示所建方法优于RT-qPCR方法。本研究建立的RT-ddPCR方法特异性强、敏感性高、重复性好,适用于临床样品的核酸检测,为牛病毒性腹泻病毒感染的早期检测和定量诊断提供了技术支持。

摘要：为了更加快速地检测牛冠状病毒(BCoV),本试验根据BCoV的具有较高保守性的N基因序列设计1对特异性引物,结合纳米金颗粒材料,通过反应条件和体系优化,建立一种新型的快速灵敏的BCoV检测方法,并应用于临床检测。特异性试验与敏感性试验结果表明,本试验建立的nano-PCR方法对BCoV特异,与牛轮状病毒(BRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)、牛副流感病毒3型(BPIV3)均无交叉反应。nano-PCR的敏感性是普通PCR的100倍,普通PCR最低核酸检测量为2.24×10^(3)copies/μL,nano-PCR最低核酸检测量为2.24×10^(1)copies/μL。应用所建立的方法对采集的43份腹泻牛的粪拭子、鼻拭子、肺部组织样品进行检测,检出BCoV阳性样品17份,普通PCR检出阳性样品11份,两种方法的符合率为100%。此次建立的nano-PCR在检测牛冠状病毒时具有更高的特异性和敏感性,对临床上的快速诊断及检测具有一定的意义。