摘要：依据多重连接依赖探针扩增技术(MLPA)的单链探针设计要求,将检测各基因位点的MPLA探针对的上游探针设计为短探针,采用化学法加以合成;将下游探针作为长探针,以不对称PCR方法制备。本文应用该技术制备了检测12个转基因玉米品系的MLPA下游探针;并用其中的2个长探针进行转基因玉米品系检测,结果表明制备探针完全符合转基因检测要求。该技术操作简单,成本低,应用价值高。

摘要：为了对临床上症状非常相似的四种水泡性动物疾病进行大批量、快速准确的检测,我们尝试用基因芯片技术来对这四种水泡性疾病进行快速鉴别诊断。用Qiaquick 96 plate Kit对扩增的39个基因目的片段进行纯化,TE调配浓度至0.36礸/礚,于GMS417点样仪上按预选设计好的布阵方式点样,然后经紫外灯照射进行紫外交联等一系列处理。用Salmon进行非特异性杂交检测芯片点样的质量。大量抽提组织中FMDV和细胞上清液中的SVDV的总RNA,随机引物反转录的同时采用随机荧光标记法,标记FMDV和SVDV。标记好的cDNA超声波随机打断后进行特异性杂交,以最佳光扫描强度进行扫描,Imagene软件扫描结果,对两者信号进行对比,结合各病毒相对应的坐标,可鉴别诊断出四种动物的水泡性疾病病毒。本方法不但快速、灵敏、准确性高,而且可实现对大批量货物的集成化检测,满足我国快速通关的要求。

摘要：为分析绵羊痘病毒L2R蛋白的分子特征,本试验提取了绵羊痘病毒固原株(GY)的基因组DNA,设计L2R基因引物,对L2R基因进行扩增,将扩增的基因连接到pGEM-T Easy载体后转化到大肠杆菌Trans 5α感受态细胞,筛选阳性克隆,进行序列测序。利用生物信息学软件对L2R基因序列进行预测分析。结果显示,L2R基因序列含有一个由279个核苷酸组成的开放阅读框,编码92个氨基酸残基组成的多肽,蛋白质分子质量理论值为10.92ku,理论等电点为6.56。该蛋白质二级结构组成分别是α-螺旋占69.57%,β-折叠占9.78%,无规则卷曲占8.70%,延伸链占11.96%。多序列比对分析结果显示,不同羊痘病毒分离株L2R序列高度保守。进化树分析结果显示,GY株与NK、TU及SA株在一个分支,表明它们之间亲缘关系较近。本试验结果为进一步研究L2R蛋白的生物学功能和羊痘病毒早期蛋白的分子相互作用奠定了基础。

摘要：为了建立检测口蹄疫的快速实用分子生物学技术,本研究借助新兴的环介导等温扩增技术,建立了一种灵敏、特异、快速的分子生物学检测方法-体外等温扩增检测方法。设计了6条针对FMDV3D基因的8个位点的特异性引物,建立了一套从核酸抽提到检测仅需要75min的快速检测技术。所建立的检测方法灵敏,与实时荧光RT-PCR灵敏度相当;且具有特异性,对其他水泡性疾病病原体检测均为阴性;而且简单,不需要复杂的仪器,常规水浴锅在63.5℃即可进行,肉眼可直接观察检测结果。该方法是适合基层和现场检测而无需送至中心实验室的快速灵敏实用的分子生物学检测方法。

摘要：为建立快速检测绵羊痘病毒(SPPV)快速检测方法基因的方法,本研究参照SPPV ORF068基因设计并合成一对特异性引物和一条MGB探针,经条件优化,建立了SPPV TaqMan-MGB荧光定量PCR快速检测方法。结果显示,该方法可以特异性检测SPPV,而对羊口疮病毒和猪水疱病病毒等扩增结果均为阴性;而且检出下限为10拷贝/μL;组内组间重复性试验的变异系数均小于3%。上述结果显示本研究建立的TaqMan-MGB qPCR方法特异性强、灵敏度高、重复性好,能够对SPPV进行快速准确的检测。

摘要：通过对猪、绵羊CD58mRNA序列比对,设计出绵羊CD58的特异性引物,应用反转录PCR技术从绵羊淋巴细胞mRNA中扩增出绵羊CD58基因,将该基因克隆到原核表达载体pGEX4-1中进行原核表达.结果表明:克隆出的绵羊CD58cDNA长807bp,其中包含了开放式阅读框;该基因在大肠杆菌中进行表达,SDS-PAGE电泳在53ku处能观察到特异表达的融合蛋白,产物通过Western-blot检测证实,可以被CD58单克隆抗体识别.

摘要：基于氨基酸序列和采用Gamier-Robson和Chou-Fasman等多种方法分析的α-螺旋、β-折叠和转角等二级结构结果,预测小反刍兽疫病毒N蛋白的B细胞抗原表位。设计4段多肽并进行人工合成,作为包被抗原建立小反刍兽疫血清抗体间接ELISA检测方法,用于检测小反刍兽疫山羊临床血清样品,以对预测的B细胞抗原表位进行验证。结果显示,研制的间接ELISA敏感性为96.0%,特异性为96.25%,与进口标准竞争ELISA试剂盒的符合率为96.15%。结果表明,研制的间接ELISA方法适用于小反刍兽疫临床血清抗体的检测。

摘要：为进一步研究高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白的结构、功能及免疫学特性,提取PRRSV云南分离株A06RNA,设计特异性引物扩增全长N基因,得到长度为372bp的目的片段,克隆至杆状病毒Bac-To-Bac表达载体pFastBac HTB中,转化大肠埃希菌DH10Bac进行同源重组,成功构建了含有N基因的真核表达载体,转染Sf9细胞,回收得到重组杆状病毒。SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,表达产物17ku,与预期大小一致,能与PRRSV阳性血清产生特异性反应。