摘要：目的克隆口虾蛄原肌球蛋白(tropomyosin)基因并表达纯化出重组蛋白,研究其变应原性。方法提取口虾蛄总RNA,设计特异引物,通过反转录聚合酶链反应克隆出目的基因片段,测序后将该片段克隆到原核表达载体pET-28a上,转化到***21(DE3)后,经异丙基-B-D-硫代乳糖苷(IPTG)诱导表达,用Ni2+亲和层析柱对重组变应原进行纯化。采用免疫印迹(Western-blot)检测其与对虾过敏的患者血清IgE结合活性。结果经序列测定,该基因含有长度为855bp的开放阅读框,编码284个氨基酸(GenBank登录号为EF584510)。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测该重组变应原在大肠埃希菌中高效表达36kDa的目的蛋白,且重组变应原具有良好的IgE结合活性。结论本研究成功获得了具有变应原活性的重组口虾蛄原肌球蛋白。

摘要：目的克隆和表达粉尘螨第7类变应原基因,并鉴定重组蛋白的免疫原性。方法提取粉尘螨总RNA,根据GenBank提供的Der f 7编码区(CDS)(登录号为AY 283292)序列设计特异性引物,逆转录PCR(RTPCR)克隆Der f 7基因。将测序正确的目的片段克隆至pET-32a表达载体,得到的重组质粒pET-32a-Der f 7在大肠埃希菌(***)BL21(DE3)中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,通过镍离子亲和层析纯化目的蛋白。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测目的蛋白表达和纯化结果,蛋白质印迹(Western Blotting)分析重组蛋白的免疫原性。结果RT-PCR结果显示,Der f 7基因片段大小约为650 bp。测序结果表明,Der f 7基因片段与已发表的粉尘螨Der f 7基因(登录号为FJ436108)同源性为99%。SDS-PAGE结果显示,重组质粒pET32a-Der f 7在BL21(DE3)中高效表达,重组蛋白相对分子质量(M r)约为23 000。Western Blotting分析结果表明,Der f 7重组蛋白可被尘螨过敏患者血清识别。结论成功构建了粉尘螨第7类变应原的原核表达载体,并获得具有免疫原性的Der f 7重组蛋白。

摘要：目的克隆美洲大蠊(Periplaneta americana)精氨酸激酶(arginine kinase,AK)基因并表达、纯化具有变应原活性的重组AK。方法提取美洲大蠊总RNA,设计特异引物,通过RT-PCR克隆美洲大蠊AK基因目的片段,测序后将该片段克隆入原核表达载体pET-28a,转化至大肠埃希菌(***)BL21(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,获重组AK。用镍离子(Ni2+)亲和层析柱纯化,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组AK表达情况。用蛋白质印迹分析(Western blotting)(变性条件)和ELISA(非变性条件)检测重组AK变应原与过敏患者血清IgE结合活性,并以健康人血清为对照。结果测序结果表明,AK基因含有1068bp的开放阅读框,编码356个氨基酸(登录号为EU429466)。与Gen Bank公布的序列(登录号为AY563004)比较同源性达99.9%。SDS-PAGE分析表明,该变应原基因在***中主要以可溶形式高水平表达,相对分子质量约为Mr45000。重组变应原AK在变性与非变性条件下,与过敏患者血清IgE均具有良好的结合活性,与健康人对照组之间的差异具有统计学意义(P<0.05)。结论获得了具有变应原活性的重组美洲大蠊精氨酸激酶。

摘要：目的应用PCR技术检测空调空气滤网灰尘中尘螨变应原Der f1和Der p1的基因。方法从深圳和北京地区分别收集20台、10台空调过滤网上的灰尘样品,分别提取其生物总基因组DNA作PCR模板,分别设计Der f1和Der p1各两套内外扩增引物分两步进行PCR,通过扩增出目的片段来检测空调空气滤网灰尘中尘螨变应原Der f1和Der p1基因片段,并以深层泥土DNA提取物为阴性对照和以培养的粉尘螨、屋尘螨基因组DNA提取物为阳性对照。PCR产物经电泳后切胶回收目的片段并克隆到T载体上,进行DNA序列分析并与Gen Bank进行同源性比较分析。结果深圳地区20台空调空气滤网上收集的灰尘中均含有粉尘螨和屋尘螨主要变应原Der f1和Der p1基因片段;北京地区10台空调空气滤网上收集的灰尘样品中,只有4份均含有Der f1和Der p1;它们扩增部分的序列与GenBank数据库里相应序列同源性为100%。从阴性对照提取物中未扩增得到目的变应原Der f1和Der p1基因片段,从阳性对照的DNA提取物中分别扩增得到目的变应原Der f1和Der p1基因片段。结论本研究首次应用分子生物学技术证实了空调空气滤网上的灰尘中存在尘螨主要变应原Der f1和Der p1基因,并提示深圳地区空调过滤网灰尘中尘螨可能比北京地区的多,从而为今后防治空调中尘螨引起的变态反应性疾病提供了依据。

摘要：采用套式PCR和荧光实时定量PCR两种方法检测食品中花生主要过敏原Ara h1基因成分,从而推断食品中是否含有花生过敏原成分。根据GenBank提供的花生主要过敏原基因Ara h1 DNA序列(登录号为AF432231)的中一段序列分别设计2对内外特异性引物,扩增目的基因片段来建立套式PCR方法;再用上述内引物扩增目的片段,建立SYBRGreenⅠ荧光实时定量PCR方法,绘出拷贝数-CT标准曲线;并通过这2种PCR方法检测8种食品中含有花生主要过敏原Ara h1基因成分。套式PCR方法具有较高的特异性和灵敏度,SYBR GreenⅠ荧光实时定量PCR方法的标准曲线在3×102至3×108 copies范围内线性关系良好,R2值为0.993 5,检测低限设定为3×103 copies。2种方法检测8种食品样品,结果均与食物过敏原标注内容相符。本研究建立的2种方法具有快速、灵敏等优点,可用于食品中花生主要过敏原基因Ara h1成分的检测。

摘要：采用Taqman探针PCR技术,建立食品中花生主要过敏原基因Ara h1的检测方法。根据GenBank提供的Arah1基因(序列号AF432231)中一段DNA序列设计特异性引物与Taqman探针,扩增该目的基因,建立拷贝数-CT标准曲线,可通过标准曲线方程计算食品中含有花生主要过敏原Ara h1基因拷贝数(copies),并用于检测8种食品中是否含有残留的该过敏原基因。此标准曲线在1.5×103copies～1.5×107copies范围内线性关系良好,R2值为0.975 9;8种样品检测结果与食物过敏原标注内容相一致。

摘要：目的克隆表达粉尘螨(Dermatophagoides farinae)α-烯醇化酶(alpha-enolase,ENOA)基因,初步研究其N端B细胞表位与自身免疫性疾病的关系。方法 1设计特异性引物,从文库中克隆ENOA cDNA;2通过BamH I/EcoR I双酶切位点,将ENOA基因克隆至pET-His原核表达载体,表达纯化,获得了重组ENOA蛋白;3测定重组ENOA酶活性;4通过Swiss-Model软件模拟ENOA蛋白3D结构,并分析其潜在的N端B细胞表位;合成ENOA的N端表位肽,测定其与类风湿性关节炎患者血清IgG的反应性。结果 1克隆了ENOA全长cDNA(GenBank登录号KJ421213.1);2成功构建了pETHis-ENOA表达载体,经纯化获得了重组ENOA蛋白。3重组蛋白具有烯醇化酶活性;4瓜氨酸修饰的合成表位肽与类风湿性关节患者血清IgG-ELISA呈阳性反应,与健康对照组血清均不呈反应(P<0.05)。结论本课题首次克隆表达的重组ENOA蛋白具有烯醇化酶活性;其N端B细胞表位与类风湿性关节炎相关。本研究为尘螨与自身免疫性疾病的相关性研究提供了新的思路。

摘要：目的克隆表达粉尘螨第24组过敏原cDNA,研究其免疫学特性,为深入研究尘螨致敏机制提供基础。方法以粉尘螨cDNA文库为模板,根据Der f24基因序列(GenBank Accession ***669700)设计引物,PCR扩增Der f24cDNA,构建原核表达载体pET-His-Derf24,并经酶切鉴定和DNA测序,转化至*** BL21(DE3)plysS,用异丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG)诱导表达;重组产物经Ni 2+螯合层析纯化,获得重组的Der f24(14kDa);对重组蛋白进行IgE-Western blotting(WB)实验和IgE-ELISA实验;通过Swiss-model软件模拟Der f24的3D结构并通过DNAStar软件分析其潜在的B细胞表位,合成三个肽(位置分别为75-88aa、44-57aa和104-117aa)进行IgE-ELISA实验。结果克隆的Der f24基因cDNA序列全长为357bp,编码118个氨基酸(GenBank Accession ***064571);Der f24原核表达主要形式为不可溶的包涵体,纯化后的重组Der f24蛋白分子量约为14kDa。IgE-WB结果显示,重组Der f24与10例粉尘螨过敏患者血清呈强阳性反应,而与10例健康对照组均为阴性。IgE-ELISA结果显示,合成表位肽(No.1 75-88aa:Z=5.6734、No.2 44-57aa:Z=5.6720和No.3 104-117aa:Z=5.6791;P<0.0001)均与22例粉尘螨过敏患者血清呈阳性反应,而与22例健康对照组血清呈阴性反应。结论本研究成功克隆表达了Der f24cDNA,重组Der f24可结合粉尘螨过敏血清IgE,鉴定了3个潜在的IgE B细胞表位。本研究为进一步防治螨性过敏性疾病奠定了技术基础。

摘要：通过提取屋尘螨和粉尘螨疫苗研制用的原始种子和生产种子基因组DNA作模板,分别设计Der p1和Der f1各2套内外扩增引物并进行一步法套式PCR,根据扩增出目的片段来检测尘螨变应原Der p1和Der f1基因片段,并以培养基提取物为阴性对照和已通过形态学鉴别为纯屋尘螨、纯粉尘螨的基因组DNA为阳性对照。PCR产物经电泳后切胶回收并克隆到T载体上,进行DNA序列分析并在GenBank中进行同源性比较。结果显示,从屋尘螨和粉尘螨疫苗研制用的原始种子和生产种子分别扩增出含有屋尘螨和粉尘螨主要变应原Der p1和Der f1基因片段,扩增部分的序列与GenBank数据库里相应序列同源性为100%。从阴性对照提取物中未扩增得到目的基因片段,从阳性对照DNA提取物中能扩增得到目的变应原Der p1和Der f1基因片段。本研究首次应用套式PCR技术鉴别了屋尘螨和粉尘螨原始种子和生产种子,为尘螨疫苗研制以及工业化生产提供了一种有效的质量控制手段。