摘要：目的探讨高保真聚合酶介导的分子开关突变检测技术对于筛查宫颈癌患者表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因G719S、T790M突变的价值,并分析上述突变与宫颈癌的相关性,以指导小分子酪氨酸激酶抑制剂类药物(tyrosine kinase inhibitor,TKI)的合理使用。方法设计两个位点的野生型与突变型序列的特异性引物,并硫化修饰引物的3′末端。以实验室构建的重组质粒为对照模板,进行高保真酶介导的PCR反应。将上述方法应用于临床样本的突变检测,并辅以测序验证。结果在80例宫颈癌组织以及31例癌旁组织的DNA样本中均未检测出EGFR基因的G719S、T790M突变,与DNA测序的结果一致。病例组的基因型分布频率与对照组的差异无统计学意义(P>0.05)。结论建立了检测EGFR基因G719S、T790M突变的分子开关技术平台。EGFR基因的G719S、T790M突变可能与宫颈癌无关。

摘要：目的 构建子宫内膜癌PTEN基因968delA突变检测技术平台,为临床分析PTEN基因968delA突变与子宫内膜癌的相关性提供技术支持。方法 设计PTEN基因968delA位点的特异性硫化修饰引物,以本实验室前期构建的包含PTEN基因968delA位点的突变型质粒和野生型质粒为模板,进行高保真聚合酶介导的双向引物延伸反应,采用正交设计进行PCR条件优化,再将其优化后采用突变敏感性分子开关技术检测从南华大学附属第一医院收集的62例临床患者子宫内膜组织样本PTEN基因968delA位点突变。结果 突变敏感性分子开关技术检测PTEN基因968delA位点最佳PCR反应条件为:30个循环、模板DNA(10 ng/μL)0.3μL、引物(10μmol/L)0.5μL、退火温度61℃,灵敏度达10^(-3)ng/μL。62例子宫内膜癌组织与21例正常子宫内膜组织标本均未发现PTEN基因968delA突变。结论 成功构建了子宫内膜癌PTEN基因968delA突变检测技术平台,为该技术在PTEN基因968delA的突变筛查中的应用提供了依据。

摘要：目的构建高保真酶介导的EGFR基因19外显子del18bp的突变敏感性分子开关检测平台,并对其进行优化。方法以健康人全血基因组DNA为模板,利用普通PCR与重叠PCR技术扩增分别得到包含EGFR基因19外显子del18bp的野生型和突变型DNA片段,并将其插入pMD19-T质粒,转化大肠埃希菌*** DH5α,通过菌液PCR及基因组测序进行鉴定。设计EGFR基因19外显子del18bp突变型特异性检测引物,并在3′端进行硫化修饰;用高保真聚合酶进行双向引物延伸。通过正交实验方案对高保真酶介导的PCR体系中的退火温度、引物浓度、模板浓度、循环数等条件进行优化,建立突变敏感性分子开关检测平台。结果成功建立了EGFR基因19外显子del18bp突变检测技术平台。分子开关技术检测EGFR基因19外显子del18bp突变位点的最佳PCR条件为:模板浓度1.48×10-2μmol/L,引物浓度0.16μmol/L,退火温度57℃,循环数25;对突变模板的最低检出率为10-3copies/μL。结论高保真聚合酶偶联硫化修饰构成的突变敏感性分子开关技术可望为肺癌患者实施EGFR基因突变检测,进行个体化靶向用药提供新的技术手段。

摘要：目的构建与宫颈癌组织表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因G719S和T790M位点突变型重组载体,利用其建立分子开关平台检测宫颈癌EGFR基因突变。方法以野生型重组质粒为模板,利用重叠PCR技术,得到突变型融合目的 DNA片段,再将此目的片段连接入p MD19-T质粒中,构建成突变型重组载体,将其转化入大肠埃希菌*** DH5α感受态细胞进行表达,用菌液PCR和基因组测序进行鉴定。设计特异性检测引物,建立分子开关检测平台用于临床宫颈癌样本的检测。结果通过基因组测序证实G719S和T790M突变位点成功引入,定点突变载体构建成功。成功建立了分子开关检测平台用于宫颈癌组织DNA的检测。结论利用重叠PCR技术简便、高效地构建了EGFR基因突变重组载体,并建立了分子开关检测平台,为基因定点突变及临床上检测EGFR基因突变提供了新的技术手段。

摘要：目的构建包含与宫颈癌相关的EGFR基因G719S和T790M位点重组p MD19-exon18-exon20载体,为制备突变型EGFR基因重组载体提供模板。方法以健康人全血基因组DNA作为模板,设计2对有重叠互补区的特异性引物,对EGFR基因的exon18和exon20两片段分别进行扩增,用重叠PCR技术将exon18和exon20片段进行连接,再将连接产物exon18-exon20片段插入p MD19-T质粒,构建成野生型p MD19-exon18-exon20载体,转入至大肠埃希菌感受态细胞DH5α中进行表达,利用菌液PCR和基因组测序进行鉴定。结果琼脂糖凝胶电泳结果显示,exon18和exon20两位点扩增片段在778 bp和596 bp处有清晰的目的条带,两片段的融合产物exon18-exon20片段可在1 374 bp处见一清晰目的条带;经菌液PCR和基因组测序结果鉴定,EGFR基因融合重组质粒均与预期结果一致。结论利用重叠PCR法将exon18和exon20片段进行融合,且成功构建了EGFR基因重组表达载体。