摘要：目的应用CRISPR/Cas9技术构建Slfn5基因条件性敲除小鼠模型并进行初步表型鉴定,为Slfn5功能及机制研究提供动物模型。方法根据Slfn5的基因结构,选择外显子3作为敲除区域(flox区域)。采用受精卵同源重组的方式,将针对Slfn5基因设计的gRNA(guide RNA)、Cas9 mRNA以及含有flox区域的同源重组质粒显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中并获得F0代小鼠。PCR扩增及测序鉴定阳性的F0代小鼠与C57BL/6J野生型小鼠交配,获得F1代Slfn5 flox/+杂合子小鼠。此杂合子小鼠自交,得到F2代Slfn5flox/flox纯合子小鼠。最后,将F2代Slfn5flox/flox纯合子小鼠与Dppa3-Cre鼠杂交,得到flox纯合且Cre阳性小鼠即Slfn5敲除小鼠。结果获得Slfn5敲除小鼠模型,PCR及测序鉴定为Slfn5基因条件性敲除小鼠。与野生型小鼠相比,Slfn5基因敲除的小鼠血常规中淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞数量明显增多(P<0.05)。结论应用CRISPR/Cas9技术成功建立Slfn5基因敲除小鼠动物模型,为研究Slfn5在乳腺癌和免疫系统的生物学功能及作用机制奠定实验基础。

摘要：目的克隆大鼠肾胆绿素还原酶(BVR)的cDNA序列后在大肠杆菌中表达、纯化并进行鉴定。方法采用RT-PCR方法利用设计合成的一对特异性引物从大鼠肾组织扩增BVR的cDNA序列,构建pMW172a-BVR重组质粒,转化扩增后进行序列测定,证实同GenBank[053850]公布的大鼠肾BVR的cD-NA序列相同后,阳性重组质粒转化到*** BL21(DE3)中表达并进行纯化。结果 SDS-PAGE鉴定其分子量为33 ku,分光光度仪检测具有催化胆绿素还原为胆红素的活性,证实为胆绿素还原酶。实验还测定了Km值,以NADH和NADPH分别作供氢体,测得Km值分别是380μmol/L、3.5μmol/L。结论 通过克隆表达获得了有活性的大鼠BVR酶蛋白,为进一步研究BVR的性质及功能奠定了基础,也为血红素加氧酶的研究提供了便利条件。