摘要：目的基于规律成簇间隔短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR/Cas13a)的特异性识别切割与非特异性的“反式切割”活性,建立易操作、检测限低、特异性好的核酸免扩增可视化快速检测方法—基于CRISPR/Cas13a的新型冠状病毒核酸免扩增快速检测技术。方法参照新型冠状病毒的基因序列,利用生信技术筛选并设计合成多个新型冠状病毒特异的crRNA(CRISPR RNA),以体外转录的通用ssRNA(单链RNA)靶标建立检测技术并优化检测体系,以新型冠状病毒假病毒核酸标准物来评价方法检测限。收集临床样本,其中阳性样本应包含不同的新型冠状病毒变异株,阴性样本包括其他的常见呼吸道病原体(甲型流感病毒/乙型流感病毒、人类副流感病毒、肺炎克雷伯菌等)临床样本。分别用实时荧光定量PCR(qPCR)、数字PCR及本研究建立的免扩增可视化快速检测技术,对各种样本进行检测,分析评价新建立技术的灵敏度和特异度。采用四格表确切概率法针对荧光定量PCR、数字PCR与本技术检测结果进行统计学分析,采用双侧检验,P<0.01为差异有统计学意义。结果本研究设计合成了10条crRNA,用于基于CRISPR/Cas13a的新型冠状病毒核酸免扩增可视化快速检测技术的建立与优化,本技术可在最短6 min内检出新型冠状病毒的核酸。利用新型冠状病毒假病毒核酸标准物评价该技术的检测限,结果显示仪器辅助下本技术检测限为14拷贝/μl,肉眼下检测限为28拷贝/μl。以qPCR和数字PCR确认的113份临床样本对所建立的检测技术进行敏感度和特异度分析,利用相关公式及SPSS22软件计算分析,该检测技术的敏感度98.5%(66/67),特异度100%(46/46),本研究建立的基于CRISPR/Cas13a的新型冠状病毒免扩增可视化快速检测技术检测结果与金标准qPCR检测结果差异无统计学意义(P=1)。结论本研究成功建立了一种基于CRISPR/Cas13a的新型冠状病毒核酸免扩增可视化快速检测技术,该技术流程简单、操作便捷,对操作环境要求低,检测限接近qPCR,有较强的现场检测应用潜力。

摘要：目的了解南京市德国小蠊对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性水平,建立一种快捷方便的抗性基因检测分型方法,对kdr(knockdown resistance,kdr)基因突变进行检测和分型。方法利用圆球法检测高效氯氰菊酯、氯菊酯、胺菊酯以及右旋反式氯丙炔菊酯对德国小蠊的半数击倒时间(KT),PCR扩增检测kdr基因突变情况。针对1059位氨基酸位点的碱基突变设计引物建立ARMS-PCR检测方法。结果在100 mg/m剂量时,氰菊酯、氯菊酯、胺菊酯和右旋反式氯丙炔菊酯对德国小蠊试虫的KT值分别20、19、17和8 min。同时在kdr基因的1058-1059氨基酸位点处检测到6种突变基因型,并成功地建立了针对D1059K突变基因型的ARMS-PCR检测方法。结论采集到的德国小蠊对拟除虫菊酯类杀虫剂产生了不同程度的抗性,且其kdr基因存在着多种新型突变位点。

摘要：为监测东南沿海舟山地区蝙蝠携带轮状病毒的流行情况,探索其流行机制,2015—2018年,在浙江省舟山地区采集蝙蝠,以蝙蝠肠组织为模板,设计针对轮状病毒VP3序列的特异引物进行RT-PCR检测。结果显示,2015年采集的65只蝙蝠,轮状病毒阳性率为6.15%(4/65),2016年采集的48只蝙蝠,阳性率为2.08%(1/48),2017年采集的70只蝙蝠,阳性率为2.86%(2/70),而2018年采集的101只蝙蝠,未检测到轮状病毒序列。针对2017年小菲菊头蝠Rhinolophus hipposideros体内发现的一株轮状病毒进行基因组扩增,获取部分基因组序列并进行生物信息学分析,发现VP7基因序列与蝙蝠源轮状病毒相似度最高,同源性为96%;VP3基因序列与人源轮状病毒同源性为90%;VP6基因序列与猫同源性为95%。根据上述结果,我们推测舟山蝙蝠来源轮状病毒是一株重组病毒株,具有潜在跨种传播给人类的可能性。本研究系首次在东南沿海舟山地区蝙蝠体内检测到轮状病毒,对该地区轮状病毒的监测和预警具有一定的公共卫生意义。