摘要：【目的】棕榈疫霉是农林业生产上的一种危害严重的病原菌,建立棕榈疫霉的快速分子检测技术对于预测疫病发生情况、及时采取有效的防治方法控制疫病的传播和流行、减少经济损失具有重要意义。【方法】采用环介导等温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),建立了以基因间隔区(intergenic spacer,IGS)为靶标的快速、简单、特异和灵敏的棕榈疫霉菌的检测方法。以IGS基因为靶序列,利用环介导等温核酸扩增技术,设计了多组LAMP引物,同时建立并优化了LAMP反应体系与条件,最终筛选出1组扩增反应结果较好的LAMP引物,采用该组引物进行特异性、灵敏度和实际应用的验证。在扩增前加入染料羟基萘酚蓝(HNB)作为反应指示剂,根据HNB的颜色变化判定反应结果。【结果】整个检测过程在等温64℃条件下仅需80 min即可通过肉眼直接目测试验结果。在特异性试验中,通过HNB显色只有在棕榈疫霉菌株中能观察到天蓝色的阳性反应,而在其他疫霉、腐霉和真菌的供试菌株仍为紫色的阴性反应;在灵敏度试验中,PpIGS-LAMP技术检测灵敏度达到10fg.μL^(-1)目标菌纯DNA;在实际应用中,PpIGS-LAMP技术能够快速检测出采自田间的木薯根部土壤中目标菌和人工接种发病木薯组织样品的目标菌。【结论】本研究在国内外首次采用环介导等温扩增技术检测棕榈疫霉,建立了1种快速、高灵敏度、高特异性、可视化的棕榈疫霉的LAMP检测方法。建立的棕榈疫霉菌的LAMP检测方法在80 min内可完成待检样品的检测过程,显著缩短检测时间,降低基层部门的检测成本,为棕榈疫霉引起疫病的检疫和所致病害的快速诊断提供了新的检测技术。

摘要：我国幅员辽阔、地大物博,是一个多民族国家。其不同的地域性与多样性造就了民族艺术之花长盛不衰。民族声乐艺术不仅吸收了我国各民族地区的艺术夏感和内涵,还加以浓缩使之成为精华。古老的故事和传说,民间的小调和唱词,都是民族声乐艺术灵感的来源。从广义上说黄梅戏也是民族声乐的一种。这种地方戏曲艺术的产生,发展演变以及成熟都离不开民族声乐艺术的影响和熏陶。民族声乐艺术充实完善了地方戏曲,地方戏曲继承发展了民族声乐艺术,可以说二者是相互影响,相互促进;既有区别,又有联系。

摘要：为探讨林木外生菌根真菌的分子检测方法,利用真菌通用引物ITS1-F/ITS4-B扩增了外生菌根真菌彩色豆马勃的核糖体DNA内转录间隔区并进行了序列测定.通过序列比较,设计了一对彩色豆马勃特异性引物PtF/PtR.利用该对特异性引物与ITS1-F/ITS4-B组合进行巢式PCR,能从供试的彩色豆马勃10个菌株中特异性地扩增出1条347 bp的条带,而供试的其他6个参比菌株未出现扩增产物.经分析,该巢式PCR检测技术的灵敏度可达到10 fg的DNA,是常规PCR检测的1 000倍.利用该技术从马尾松苗木菌根中检测到目的外生菌根真菌.这表明采用本研究设计的特异性引物,利用巢式PCR技术可以灵敏、准确地从林木外生菌根中检测出彩色豆马勃.

摘要：[目的]为了构建松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)果胶酶Bxpel2基因干扰载体。[方法]通过Trizol法提取松材线虫总RNA,反转录合成c DNA,设计带T7启动子的果胶酶Bxpel2基因引物,以c DNA为模板扩增出果胶酶Bxpel2基因片段,连接到RNA干扰载体,再以干扰载体为模板,PCR扩增出目的片段后进行测序鉴定,合成果胶酶Bxpel2基因双链RNA(dsRNA),采用RT-PCR检测松材线虫Bxpel2基因干扰后的表达情况。[结果]表明:1)提取的松材线虫总RNA完整性好,无降解;2)成功克隆出松材线虫果胶酶Bxpel2基因片段(790 bp)并将其连接至p MD19-T载体;3)以RNA干扰载体为模板合成dsRNA,浓度分别为1.313 mg·m L-1和1.152 mg·m L-1;4)RT-PCR结果显示,松材线虫经过dsRNA干扰后,Bxpel2基因表达基本受到抑制。[结论]成功构建松材线虫果胶酶Bxpel2基因干扰载体,为进一步研究Bxpel2基因在松材线虫致病过程中的作用和功能奠定了良好的基础。

摘要：长期或不当施用草甘膦会对非靶标生物和环境造成破坏作用。微生物是生物修复的重要生物资源,利用微生物及其产生的降解酶处理环境中有机磷农药的方法,已显示出良好的应用前景,是近年来研究有机磷农药降解的主要发展方向。研究分离松树根际土壤的高效解磷细菌多噬伯克霍尔德氏菌(Burkholderia multivorans)WS-FJ9菌株对草甘膦的降解特性及其降解条件的优化。采用添加不同浓度草甘膦NA平板接种WS-FJ9菌株观察其对草甘膦的耐受性;分别以草甘膦为唯一碳源、氮源或磷源,探讨WS-FJ9菌株对草甘膦的利用状况;采用低进水量间歇式反应器法(FBR)测定了WS-FJ9菌株降解草甘膦动力学参数;利用Plackett-Burman(PB)、Central Composite Design(CCD)试验设计及响应面分析法(RSM)筛选与优化影响WS-FJ9菌株降解草甘膦的主要因素。WS-FJ9菌株有效降解草甘膦的最大耐受浓度为0.4%;WS-FJ9菌株在以草甘膦为唯一碳源、氮源或磷源培养基上均能正常生长;WS-FJ9菌株对草甘膦的亲和性常数(K s值)为65μL/mL,对草甘膦降解的极限浓度(S min)为21.9μL/mL;通过PB试验,筛选出3个影响菌株降解草甘膦的关键因素为培养温度、葡萄糖及硫酸铵的加入量,通过CCD设计及响应面法优化分析得到影响草甘膦降解率的关键因素的二阶模型,确定了WS-FJ9菌株降解草甘膦的最优实验操作条件为:培养温度27.7℃,葡萄糖和硫酸铵的加入量分别为0.67、0.50 g/L。实验条件下WS-FJ9菌株对草甘膦的降解率最高为72.83%。

摘要：采用美味牛肝菌(Boletus edulis,简称Be)、黄色须腹菌(Rhizopogen luteous,简称Rl)及其混合菌剂分别对湿地松苗接种,以小区对比试验设计,观测接种后的湿地松菌根形成率、成活率、生长量及叶绿素含量。结果表明:接种外生菌根真菌可以显著提高湿地松的菌根形成率和成活率,增加松苗叶绿素含量,对松苗具有显著的促生长效应。同时对接种后的湿地松根际土壤微生物数量进行了测定,结果表明:湿地松根际细菌数量显著增多,真菌数量显著减少,放线菌数量明显增多。

摘要：为了研究松材线虫在我国的群体遗传关系及传播路径,获得更为稳定的松材线虫分子标记,使用MISA软件对松材线虫全基因组10 432条DNA片段进行搜索,共获得95个gSSR位点。其中,二核苷酸重复出现频率最高,占全部SSR位点的66.3%。依据所有gSSR位点共设计出36对引物,以1份松材线虫DNA pooling(包含我国46个不同地理来源的松材线虫虫株DNA)为模板进行PCR,产物由QIAxcel全自动凝胶电泳分析系统检测,获得17对可能具有多态性的gSSR引物。进一步对这17对引物的PCR产物进行单克隆试验并测序,BioEdit软件拼接比对结果表明,其中9对确实具有多态性。

摘要：大豆疫霉侵染大豆引起的根腐病是大豆生产上的毁灭性病害之一。本研究以Ypt1基因作为靶标,利用环介导等温扩增(LAMP)技术,设计了特异性检测体系,整个过程仅需60 min,即可通过肉眼直接目测检测结果。反应后经浊度仪验证浊度变化、琼脂糖凝胶进行电泳验证和在扩增前加入染料HNB(羟基蔡酚蓝)作为反应指示剂验证扩增结果。特异性检测中,111个大豆疫霉菌株均能产生浊度曲线和扩增到梯形状的条带,同时HNB显色观察到天蓝色的阳性反应,而其它疫霉、腐霉和真菌供试菌株中均没有观察到这些现象;在灵敏度检测中,PsYpt1-LAMP技术最低检测限达到100 pg·μL^(-1),比普通PCR技术的最低检测限高出10倍;在田间应用方面,PsYpt1-LAMP检测技术明显提高了检测效率。本研究建立的LAMP检测体系可用于口岸和田间对大豆疫霉的快速检测。

摘要：根据松材线虫核糖体DNA内部转录区设计了一对特异引物F11/R11与探针TaqMan-11,构成松材线虫实时PCR检测方法。采用该检测方法对分离自枯死松树体内的松材线虫、拟松材线虫、大核滑刃线虫、霍夫曼尼伞滑刃线虫和长尾属线虫进行检测。结果显示,所有松材线虫株系都能够检测到荧光信号,而拟松材线虫、大核滑刃线虫、霍夫曼尼伞滑刃线虫、长尾属线虫以及对照均没有检测到荧光信号。表明探针Taq-Man-11与引物组合对松材线虫具有很强的特异性。此外,利用检测方法,在10μL的反应体系中,最少可以检测到0.005pg的松材线虫DNA含量。实时PCR也可以成功地检测出单条松材线虫。

摘要：将松材线虫RAPD特异片段OPM05-X2100进行分离、回收,与载体pGEM-TVector连接,转化大肠杆菌并培养,对目标克隆测序。根据测序结果,用Oligo5.0软件设计引物,正向引物为M05F2(5'-CGGGT CATGG CTGGA GGTAT CGT-3'),反向引物为M05R1(5'-TGGCT CAATG GCAAA TCCTT CGTA-3'),成功地将松材线虫特异片段OPM05-X2100通过引物对M05F2/R1转化为SCAR-M05-X600。运用SCAR标记引物M05F2/R对枯死松树体内分离的92份线虫样本的DNA进行标记,并对单条线虫经简易方法提取的DNA进行检测。结果表明:引物组合对所有81份松材线虫株系均扩增出一条600bp的清晰、明亮的条带,而对8份拟松材线虫、1份霍夫曼尼伞滑刃线虫、1份大核滑刃线虫、1份长尾属线虫均无扩增产物。该对引物可以检测单条松材线虫。利用这对特异引物组合可构建松材线虫检测试剂盒,实现对松材线虫的快速检测的目标。