摘要：[目的]本研究通过优化试验条件,建立基于HDR-CRISPR/Cas9基因编辑技术快速、准确地将外源基因定向插入鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus, DEV)基因组的方法,为以DEV为载体的重组疫苗的研制奠定基础。[方法]分离并扩繁DEV疫苗株,测定其病毒滴度。根据DEV疫苗株UL26、UL27基因间非编码区序列,设计合成向导RNA(gRNA),经双链退火获得目的片段,通过基因克隆技术将其插入PX459-V2.0载体获得gRNA-Cas9质粒。同时,通过常规基因克隆技术将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因插入PVAX-1载体,构建含有真核表达盒P_(CMV)-EGFP-BGH pA的重组表达质粒。以DEV疫苗株基因组为模板,扩增gRNA上、下游同源臂序列,通过融合PCR将同源臂序列与真核表达盒P_(CMV)-EGFP-BGH pA进行连接并克隆至PUC19载体获得供体质粒PUC19-UP-EGFP-DOWN。采用先转染质粒后感染亲本DEV的策略构建重组病毒rDEV-EGFP,通过控制单一变量法优化重组病毒构建的试验条件,根据不同条件下绿色荧光蚀斑数量确定最佳条件。利用有限稀释法筛选并纯化表达绿色荧光的蚀斑,获得重组病毒rDEV-EGFP,并对其进行遗传稳定性及体外复制能力的评估。[结果]PCR扩增及测序结果显示,成功构建靶向DEV基因组UL27与UL26基因间非编码区序列的gRNA-Cas9质粒及包含EGFP真核表达盒的供体质粒。鸡胚成纤维细胞(chick embryo fibroblast, CEF)中转染gRNA-Cas9及供体质粒后感染DEV,在荧光显微镜下可观察到绿色荧光蚀斑,表明成功利用HDR-CRISPR/Cas9基因编辑技术将EGFP报告基因敲入DEV基因组。优化后的最佳试验条件为:DEV感染复数(MOI)为0.2、gRNA-Cas9质粒与供体DNA转染比例为1∶2、供体DNA的转染形式为DNA片段、转染与感染时间间隔为6 h、重组病毒收取时间为DEV感染后48 h,优化后EGFP报告基因的敲入效率显著提高(P<0.05)。重组病毒rDEV-EGFP在CEF中连续传代15次,EGFP真核表达盒仍稳定整合在UL26与UL27基因之间的非编码区,具有良好的遗传稳定性。生长曲线结果显示,重组病毒rDEV-EGFP在CEF中的复制能力与DEV疫苗株无明显差异,生长趋势一致,具有良好的体外复制能力。[结论]本研究建立了一种基于HDR-CRISPR/Cas9基因编辑技术快速构建重组DEV的方法,成功构建了具有良好遗传稳定性及体外复制能力的重组病毒rDEV-EGFP,为重组DEV载体疫苗候选株的研制提供了理论依据及技术平台。

摘要：【目的】探索犬细胞毒性T细胞相关抗原-4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4)胞外区作为免疫佐剂的可行性。【方法】根据已发表序列设计引物,用RT-PCR扩增CTLA-4胞外区编码序列,用PCR扩增犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)VP2蛋白主要抗原表位基因片段VP2S,将VP2S克隆入含和不含CTLA-4胞外区基因片段的原核表达质粒pQE-31;用获得的重组质粒pQE-CTLA-4-VP2S和pQE-VP2S转化大肠杆菌,并进行诱导表达;用相同剂量的重组蛋白VP2S和CTLA-4-VP2S免疫小鼠,用间接ELISA和血凝抑制试验比较两个免疫组的抗体水平。【结果】经过30次循环PCR扩增后,琼脂糖凝胶电泳显示预期大小的扩增产物;序列测定结果显示,克隆的毕格犬CTLA-4胞外区与已发表序列的核苷酸同源性为99.2%,氨基酸序列同源性为98.4%,结合B7分子的六肽基序(MYPPPY)无变化;VP2S与已发表CPV VP2的核苷酸序列同源性为99%,氨基酸序列同源性为98.6%;经IPTG诱导后,两种重组大肠杆菌表达预期的29kDa VP2S和42kDa CTLA-4-VP2S重组蛋白,两者均能被CPV抗血清识别;间接ELISA和血凝抑制试验结果显示,CTLA-4-VP2S免疫组的抗体产生时间为初免后第2周,抗体高峰期为初免后第4周,而VP2S免疫组的抗体产生时间为初免后第4周,抗体高峰期为初免后第5周,两个试验组高峰期ELISA抗体效价和血凝抑制抗体效价分别相差100倍和10倍。【结论】犬CTLA-4胞外区可作为分子佐剂促进CPV VP2蛋白抗体的产生。

摘要：为了更好地适应现代动物医学的发展,促进动物内科病为现代畜牧业生产服务,笔者从课程设计理念、课程内容、教学模式、教学方法、教学资源、考核模式等方面对动物内科病课程进行了全面、认真的设计。

摘要：为建立快速检测血清4型禽腺病毒病(Fowl aviadenovirus serotype 4,FAdV-4)的基于Taq Man探针的Quantitative real-time PCR(qPCR)检测方法,本研究根据Hexon基因序列,设计相关的qPCR特异性引物和探针,经特异性、敏感性和重复性试验以及反应程序等系列优化后,最终建立荧光定量检测方法并应用于临床样品的病原检测。FAdV-4的qPCR结果表明,优化后标准曲线决定系数(R^(2))为0.998,扩增效率(E)为95.226%,该方法效果良好。利用该方法,除FAdV-4外其他禽类常见病原均未检测到,该方法具有良好的特异性。该qPCR方法检出阳性的最低拷贝数为100个拷贝,而普通PCR方法检出阳性的最低拷贝数为10000个拷贝,说明其具有良好的灵敏度。组内和组间变异系数均≤0.22%,该方法的重复性较高。对180份从江苏、安徽、江西和广西等省份采集的临床疑似样品进行检测,结果显示,qPCR方法检出率为51.1%,而普通PCR方法检出率为32.8%;同时基于qPCR引物的检出符合率为100.00%,而基于普通PCR特异性引物检出的符合率为82.35%,表明该qPCR方法针对临床疑似样品的检测准确性更高。该方法的建立有助于推动禽腺病毒病的分子流行病学研究和防控。

摘要：本研究根据鹅Ⅰ型星状病毒(GAstV-1)的保守基因序列设计一对特异性引物和探针,建立并优化荧光定量PCR检测方法,并分别进行了特异性、敏感性、重复性进行了试验,且采用田间样品进行验证。结果显示,本研究建立的检测方法与新城疫病毒(NDV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)、禽流感病毒AIV(H9N2)、鹅细小病毒(GPV)、鹅圆环病毒(GoCV)、水禽大肠杆菌(***)、鸭疫里默氏杆菌(RA)均无交叉反应;对重组质粒标准品的检测限为1.0×10^(1)copies/μL,组内和组间的变异系数均≤1.00%。13份田间临床样品检测结果显示,本研究建立的荧光定量PCR法阳性检出率为100%。由此可见,本研究建立的GAstV-1荧光定量PCR特异性强、灵敏度高、重复性好,为鹅星状病毒的检测和监测提供了有效的技术手段方法。

摘要：旨在建立一种针对鸭甲肝病毒1型(DHAV-1)和鸭甲肝病毒3型(DHAV-3)的高效快速、高灵敏度和高特异性的双重TaqMan实时荧光定量PCR(q-PCR)检测方法并应用于临床疑似样品检测。根据DHAV-1和DHAV-3的VP1基因保守区域,分别设计合成了2对特异性引物和探针,在此基础上建立并优化了双重TaqMan实时荧光定量PCR方法。结果显示:优化后标准曲线的相关系数(R2)均在0.999以上,扩增效率(E)在105%~110%,其组内变异系数(i-CV)与组间变异系数(c-CV)均在0.77%以下。运用双重q-PCR方法对不同稀释度的混合质粒与病毒核酸进行检测,结果表明,建立的双重TaqMan q-PCR特异性高;同时检测DHAV-1和DHAV-3的灵敏度均可达10个拷贝,分别是常规PCR方法的1000倍和100倍。对40份来自苏中、苏北地区的疑似鸭肝炎病毒感染的鸭组织病料进行检测,结果表明,q-PCR方法检出36份阳性病料,阳性率为90%;而常规PCR方法未能检出高Ct值的样品,阳性率为72.5%(29份阳性病料)。建立的双重TaqManq-PCR检测方法为DHAV-1与DHAV-3的临床样品检测提供了高效、灵敏、特异的工具,推动了临床分子流行病学调查及病毒定量分析等研究。

摘要：试验旨在利用杆状病毒表达系统制备输卵管特异表达人溶菌酶(h LYZ)的重组禽腺联病毒(recombinant avian adeno-associated virus,r AAAV)。参照已发表的h LYZ基因序列设计1对引物,PCR扩增h LYZ基因片段,亚克隆至含输卵管特异表达盒和禽腺联病毒(AAAV)两侧末端反向重复序列(inverted terminal repeat,ITR)的转移载体中,获得重组杆状病毒转移载体p FB-AIOVLYZ,将其转化到大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒r Bacmid-AIOVLYZ,在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒r Bac-AIOVLYZ。将其与表达AAAV结构蛋白的重组杆状病毒r Bac-VP及表达AAAV功能蛋白的重组杆状病毒r Bac-Rep以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为5感染Sf9昆虫细胞,72 h后收集细胞沉淀,并经滤膜过滤、氯仿抽提和PEG沉淀,即为r AAAV-OVLYZ。电镜结果显示,病毒粒子大小约为20 nm,形态结构与野生AAAV相似;PCR结果显示r AAAV含有目的基因;体外细胞表达试验说明r AAAV能介导h LYZ在输卵管细胞中的特异表达。结果表明,本研究利用杆状表达系统成功制备了输卵管特异表达h LYZ基因的r AAAV,为h LYZ的大量制备奠定了基础。

摘要：为实现鸭坦布苏病毒(duck tembusu virus,DTMUV)的快速检测,本研究根据GenBank中公布的DTMUV E蛋白基因的高度保守序列设计了1套引物,通过优化反应体系各组分的浓度、反应时间和温度,建立了一种灵敏、便捷的RT-LAMP扩增方法。结果显示,在最佳条件下甜菜碱对反应体系影响不明显;该方法灵敏度是常规RT-PCR的100倍;只能特异性扩增坦布苏病毒,对于其他常见的禽源病毒无特异性扩增;检测结果可直接通过肉眼观察来判断;对临床74份疑似病料,可检出65份。本试验建立的方法灵敏性高、特异性强,可用于鸭坦布苏病毒病的临床诊断和流行病学调查。

摘要：研究20%树脂包被替米考星颗粒在猪体内的药代动力学特性并评价其(受试制剂T)与国际(R1)国内(R2)两种参比制剂的生物等效性。采用随机三制剂、三周期自身交叉试验设计,选取6头健康的阉割过的小公猪(体重20.7±2.6 kg),分别口灌给药三种制剂(10 mg/kg b.w.),采用高效液相色谱法(HPLC)测定血浆替米考星浓度,利用Kinetica 5.0分析药代动力学特性及生物等效性评价。20%树脂包被替米考星颗粒在猪体内的药时曲线符合带一级吸收的二室开放模型;T、R1、R2的C_(max)分别为(0.2830±0.0292)、(0.2815±0.0291)、(0.4087±0.0421)μg/mL,t_(max)分别为(4±0.9832)、(0.75±0.1581)、(1±0.2458)h,AUC_(0-∞)分别为(10.8715±1.1203)、(9.8715±1.0173)、(10.6441±1.096 9)μg·h·mL^(-1);受试制剂相比于两种参比制剂的相对生物利用度分别为110.13±6.04%(R1)和102.63±9.64%(R2)。结果表明,三种制剂间具备生物等效性;20%树脂包被替米考星颗粒有更好的缓释作用,具有一定的生物安全性,在体内保持药效时间更久。

摘要：《动物防疫技术》是农业高职院校动物防疫与检疫专业的一门核心职业技术课程,目标是培养学生具有动物疫病的预防、控制和扑灭的能力。本文从课程设置、设计思路、教学内容、教学实施、课程考核、教学资源和教学效果等方面详细介绍了基于任务驱动式《动物防疫技术》教学设计,为高职动物防疫与检疫专业的教学改革提供思路。