摘要：目的从临床标本中扩增人偏肺病毒（hMPV）基因片段进行亚克隆，为进一步全面深入地研究人偏肺病毒奠定基础。方法根据GenBank中已知的hMPV全基因序列设计引物。收集呼吸道感染住院患儿鼻咽抽吸物697例，提取病毒核酸，运用长片段RT-PCR技术扩增目的片段，切割舍目的条带的凝胶进行纯化，并将目的片段连接到PJET1．2／blunt克隆载体，转化感受态细胞TOP10，经含氨苄青霉素的抗生素平板筛选，得到阳性克隆，提取质粒，最后对重组质粒进行PCR鉴定和测序鉴定。结果随机选取5例所获的阳性条带经PCR和测序鉴定，证实确为hMPV基因片段。结论成功构建了hMPV基因组亚克隆，可用于后续的实验研究。

摘要：目的建立多重RT—PCR技术检测儿科呼吸道标本中常见病毒的方法。方法参照病毒核酸序列设计多重RT—PCR引物，并检索NCBI数据库初步验证其特异性，以实验室阳性株验证引物特异性，优化多重RT—PCR反应条件。并对2008年61份儿童呼吸道标本进行检测，阳性片段测序验证扩增片段特异性。结果采用多重RT—PCR引物对流感病毒A型（IVA）、流感病毒B型（IVB）、副流感病毒1型（PIVl）、副流感病毒3型（PIV3）、呼吸道合胞病毒（RSV）和鼻病毒（RHV）等6种病毒进行扩增，均无非特异性扩增条带，分剐获得171，489，307，585，155，501bp片段，与设计相符；对引物的相关性实验结果表明引物之间不会因相互干扰而出现假阳性结果，61份儿童呼吸道标本多重RT—PCR扩增，阳性率为50．82％（31／61），核酸序列与经NCBI数据库Blast比对同源性高。结论实验证明，所建立的多重RT—PCR技术检测儿童呼吸道标本中常见病毒的方法，敏感度、特异度和可重复性均较好，为常见呼吸道病毒检测提供了一种方便易行的方法。

摘要：目的建立一种快速、特异的可同时检测血中多种病毒性肝炎相关病毒的多重PCR方法。方法参照各病毒特异性核酸序列,按多重PCR引物设计的特殊要求设计引物,以核酸测序确证扩增产物,用标准病毒株及临床阳性血清样本DNA、RNA为模板优化PCR反应体系和反应条件,建立病毒性肝炎相关病毒多重PCR检测方法。应用建立的多重检测方法对120例ALT升高的血清标本进行多重检测,并将检测结果与单一PCR检测结果进行比较。结果采用多重PCR技术可同时对EBV、TTV、HBV、HSV 4种DNA病毒进行扩增;采用多重RT-PCR技术可同时对Cox-V、HEV、HCV 3种RNA病毒进行扩增。各病原体单一及多重扩增条带均清晰、均一,无非特异性扩增条带,片段长度与理论值一致;核酸测序证实各扩增产物属各病原体特异性基因片段。临床标本检测多重感染率为19.2%,与单一检测结果一致。结论建立的多重PCR检测方法稳定可靠,敏感度、特异度好,适用于病毒性肝炎相关病毒的实验室诊断与临床筛查。

摘要：目的在GeXP系统中应用CY5标记的特异引物代替通用引物,建立一种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的方法。方法设计mecA与nuc基因引物,经聚合酶链反应(PCR)扩增琼脂糖电泳验证引物特异性并优化PCR反应条件。用荧光染料CY5标记单条引物(单独标记上游或下游引物)。以提取的MRSA、甲氧西林耐药凝固酶阴性葡萄球菌(MRCNS)、甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)核酸为模板液,采用已标记引物进行单重及多重PCR,产物经琼脂糖电泳与GeXP毛细管电泳分析,验证应用效果。再通过采用混合标记引物的GeXP系统检测100株MRSA,分析其应用效果。结果单标记下游引物的GeXP-PCR的杂质扩增峰较少。经GeXP系统检测分析的MRSA、MRCNS、MSSA均出现目的特征峰,能明确辨别其含有大小不同的基因片段,结果与琼脂糖电泳一致;经GeXP系统分析的100株MRSA均含有nuc与mecA片段,与VITEKⅡCompact检测结果相符。结论单独标记下游引物应用于GeXP检测MRSA的方法可行。

摘要：目的基于多重基因遗传信息表达分析系统(Ge XP)技术平台,应用CY5(荧光染料)标记的特异引物代替通用引物,建立一种高通量的葡萄球菌多重耐药基因检测法。方法设计细菌16S rDNA、耐甲氧西林相关基因(mecA、MecA LGA251)与耐大环内酯类相关基因(ermA、ermB、ermC、sat4、msrA、ereA、ereB、mefA/E)的引物,经"PCR+琼脂糖电泳"筛查2014年1月—2016年12月中山大学附属第八医院129株耐甲氧西林或者耐红霉素葡萄球菌基因,同时优化PCR。用CY5标记上游引物5'端,制作Ge XP多重PCR引物。应用多重PCR扩增多重耐药基因核酸,产物经琼脂糖电泳与Ge XP毛细管电泳,分析电泳图优化PCR。应用优化后的Ge XP多重PCR扩增43株葡萄球菌,验证应用效果。结果 129株葡萄球菌筛出7种基因(16S rDNA、mecA、ermA、ermB、ermC、sat4和msrA)。16S rDNA、mecA、ermA、ermB、ermC和msrA引物特异性好,但不同核酸的sat4基因能扩增出两种不同大小片段。建立的Ge XP多重PCR能同时检出所有靶基因。43株葡萄球菌的检测结果与表型检测(VITEKⅡCompact System)相符;与"PCR+琼脂糖电泳"相比:sat4符合率为97.67%(42/43),无统计学差异(P>0.05);msrA符合率为95.35%(41/43),无统计学差异(P>0.05);ermA、mecA、16S rDNA、ermB和ermC符合率均为100%(43/43)。结论采用CY5标记特异引物应用于GeXP系统检测葡萄球菌多重耐药基因的方法可行,其特异性与敏感性高,若采用更多引物,其检测通量可进一步提高。