摘要：目的利用CRISPR/Cas9系统构建gsdmd基因敲除的巨噬细胞RAW264.7,为研究gasdermin D(GSDMD)在巨噬细胞中的生物学功能提供细胞模型。方法针对gsdmd基因靶向设计4条向导RNA(sgRNA),构建pGL3-sgRNA串联载体后PCR、测序鉴定,将Cas9质粒和pGL3-sgRNA串联载体分两步电转至巨噬细胞RAW264.7;qPCR检测cas9的表达;嘌呤霉素筛选出阳性单克隆后PCR、Western blot和测序鉴定。将鼠伤寒沙门菌与gsdmd-/-RAW264.7细胞共培养,AnnexinⅤ/PI染色及比色法检测乳酸脱氢酶(LDH)释放水平分析细胞死亡情况。结果qPCR结果表明获得稳定表达cas9的RAW264.7-Cas9细胞(P<0.01);PCR及测序证明pGL3-sgRNA串联载体构建成功;PCR、测序及Western blot结果表明成功构建gsdmd-/-RAW 264.7细胞。AnnexinⅤ/PI染色及LDH释放水平发现敲除gsdmd可降低巨噬细胞死亡率(P<0.01)。结论本研究利用CRISPR/Cas9系统成功构建gsdmd-/-RAW264.7细胞,为后续深入研究GSDMD介导的巨噬细胞死亡及其机制奠定基础。

摘要：海水介质的不均匀性导致声波传播过程会产生折射效应,采用平面声基阵的超短基线系统在测量过程中会受到该现象的影响,从而使测量结果产生较大的误差,通常采用声线跟踪的方法利用实测声速剖面进行声线修正。准确的波束入射角是确保声线跟踪精度的前提,超短基线系统是利用声学相位差推算得到近似波束入射角,而利用近似波束入射角进行声线跟踪会造成一定的精度损失。针对上述问题,本文提出了一种超短基线水声定位的波束入射角迭代修正方法,基于常梯度声线跟踪构建起了波束入射角与传播时间的迭代计算关系,采用埃特金加速法实现了波束入射角的非线性方程快速解算。通过仿真实验证明本文提出方法能够实现波束入射角与目标位置的准确计算,有效消除了折射效应对超短基线水下定位的影响。