摘要：利用CRISPR/Cas9基因编辑系统,建立DDX5基因敲除的PK-15细胞系。使用E-CRISPR在线设计网站分别对猪DDX5第1外显子和第2外显子设计sgRNA,以质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro(pX459)为载体,将退火后的sgRNA连接到线性化载体pX459上,得到敲除载体pX459-sgRNA-DDX5。以脂质体Lipofectamine2000转染pX459-sgRNA-DDX5至PK-15细胞,经嘌呤霉素压力筛选得到单克隆细胞,通过扩增基因组DDX5序列进行测序和Western-blot鉴定筛选细胞系中DDX5敲除效果。DNA测序结果表明:sgRNA被成功插入载体pX459,并在靶向基因编辑位点产生移码突变;经Western-blot验证,敲除细胞系中DDX5蛋白基本不表达。上述结果表明,本研究采用CRISPR/Cas9技术成功构建了敲除DDX5基因的PK-15细胞系。

摘要：利用CRISPR/Cas9技术建立敲除RNA结合蛋白(RALY)基因的PK-15细胞系PK-15-RALY^(-/-),并初步探究RALY对口蹄疫病毒(FMDV)复制的影响。根据GenBank中猪的RALY基因的外显子,设计合成sgRNA并克隆至PX459载体;将质粒转染PK-15细胞,并采用有限稀释法筛选单克隆细胞株,经Western-blot及测序检测RALY基因的敲除效果。通过RT-qPCR检测FMDV感染PK-15-RALY^(-/-)和PK-15细胞后FMDV m RNA的转录水平,Western-blot检测FMDV-VP0、FMDV-VP3和FMDV-VP1的表达水平,最后检测子代病毒感染力。测序结果证实RALY基因发生了移码突变,且Western-blot无法检测到PK-15-RALY^(-/-)细胞中RALY蛋白的表达。FMDV感染两种细胞后,RT-PCR结果显示,FMDV在PK-15细胞中的m RNA水平显著低于PK-15-RALY^(-/-)细胞,Western-blot结果显示,VP0、VP3和VP1蛋白在PK-15-RALY^(-/-)细胞中的表达显著高于PK-15细胞,病毒感染力测定结果显示,PK-15-RALY^(-/-)细胞中子代病毒滴度显著高于PK-15细胞。上述结果表明,本研究成功构建了RALY基因敲除的PK-15细胞系,首次表明RALY可以抑制FMDV复制,为进一步开展RALY在细胞内调控病毒复制机制研究奠定了基础。

摘要：目的:对角膜地形图引导下的准分子激光原位角膜磨镶术与准分子激光原位角膜磨镶术的比较研究。方法:近视眼共920例1815眼经随机得到913眼行准分子激光原位角膜磨镶术,902眼行角膜地形图引导下的激光原位角膜磨镶术(optimized refractive keratectomy,ORK)。(设备采用德国视明公司生产的第8代爱丽丝准分子激光治疗机(含有ORK治疗系统),意大利生产的角膜地形图检查仪(含有ORK检查软件系统),美国生产的CSV—1000HGT(halogen glare test)视觉对比敏感仪,法国生产的Moria—M2自动旋切式显微角膜板层刀。在医学五分验光法获取相关屈光数据后,将准分子激光治疗机检测能量数据,在角膜地形图检查仪上按设备要求输入相关的信息材料而获得该眼的数据资料,经3.5的软盘再次输入准分子激光治疗机系统,按常规准分子激光原位角膜磨镶术(LASIK)进行手术。结果:ORK手术预测性更好,手术后视力稳定,波动范围小,自觉无夜间眩光,视觉质量好,对比敏感度优于LASIK。术后角膜地形图更接近手术设计。结论:对于矫正近视眼应用ORK技术明显优于LASIK手术。