摘要：为建立一种快速、灵敏且适用于现场即时检验(POCT)锦鲤疱疹病毒(KHV)的方法,本研究根据KHVTK基因的保守序列,遵循荧光RAA引物及探针设计原则,设计多套KHV特异性引物及1条探针,通过试验筛选出最佳引物对,建立了KHV的重组酶介导等温扩增(RAA)荧光检测方法,并对该方法进行敏感性、特异性、重复性及临床样本测试。结果显示,本方法最低检测限为7.01×10^(2) copies/μL,与WOAH推荐的TK基因PCR检测方法一致(同为7.01×10^(2) copies/μL),高于Sph基因PCR检测方法(7.01×10^(3) copies/μL),低于KHV real-time PCR检测方法(7.01×10^(1) copies/μL)。RAA荧光方法特异性良好,与鲤春病毒血症病毒(SVCV)、真鲷虹彩病毒(RSIV)、金鱼造血器官坏死病毒(CyHV-2)、鳗鲡疱疹病毒(AngHV-1)、病毒性神经坏死病毒(VNNV)均无交叉反应,临床样本检测结果与WOAH推荐的两种检测方法结果一致,且仅需20 min。结果表明,锦鲤疱疹病毒RAA荧光检测方法具有简单快捷、敏感性高、特异性好等优点,可为实验室条件有限的养殖场及海关监管现场的快速病原筛查提供有效的技术手段,满足生产一线的疫病监测需求。

摘要：为了建立一种特异性好、灵敏度高的非洲猪瘟病毒(ASFV)快速检测方法,试验针对ASFV B646基因保守片段设计并合成特异性crRNA(crRNA1、crRNA2、crRNA3),并根据crRNA所在的基因序列区域设计重组酶聚合酶扩增(RPA)引物(RPA1-F/RPA1-R、RPA2F/RPA2-R),通过筛选最佳RPA引物-crRNA序列组合和crRNA浓度建立ASFV的RPA-CRISPR-Cas12a快速检测方法,在评估该方法的特异性和灵敏度后对ASFV阳性临床样本进行验证。结果表明:最佳RPA引物-crRNA序列组合为RPA2-crRNA3,最佳crRNA浓度为5μmol/L;该方法仅能检测出ASFV,不能检测出猪瘟病毒(CSFV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2),特异性良好;最低检测病毒浓度为5.8 copies/μL,灵敏度较高;应用该方法对20份ASFV阳性临床样本进行检测,结果均为阳性,符合率为100%。说明成功建立了ASFV的RPA-CRISPR-Cas12a快速检测方法,该方法特异性好、灵敏度高,可用于ASFV的现场快速检测。

摘要：目的为了高效检测棘球绦虫(Echinococcus)。方法针对棘球绦虫的线粒体基因高度同源区域设计特异性引物和探针,建立了一种检测棘球绦虫的荧光PCR检测方法。在优化反应条件并测试灵敏度和特异性之后进行样本检测。结果该方法有较高的灵敏度,检测质粒浓度极限为10 copies/μL;特异性好,未见非特异性扩增;应用该方法对84份犬粪样本进行检测,发现41份样本为阳性。结论本研究所建立的荧光PCR方法可快速、准确地检测棘球绦虫,为棘球蚴病的早期诊断和预防提供了技术支撑。

摘要：为有效鉴定高鼻羚羊(Saiga tatarica)源性成分,基于细胞色素c氧化酶亚型Ⅰ基因设计特异性引物对高鼻羚羊角、高鼻羚羊角粉,以及与其种属相近或形态学相似的动物角和动物组织的DNA进行PCR扩增,对扩增产物进行桑格测序和序列分析,并对高鼻羚羊的物种分类问题进行探讨。结果表明:所有对照样品均未见扩增条带,阳性样品与NCBI基因数据库参考序列的相似性均大于99.42%,说明桑格测序法能准确鉴定高鼻羚羊成分,但由于证据不足,无法明确该方法能否进一步区分高鼻羚羊与蒙古高鼻羚羊(***)。

摘要：为探索16S rRNA基因条形码技术在濒危脊椎动物物种鉴定中的可行性,选取脊椎动物线粒体16S rRNA基因中长度为286 bp的片段设计通用引物,以哺乳纲(Mammalia)、爬行纲(Reptilia)、两栖纲(Amphibia)、软骨鱼纲(Chondrichthyes)和辐鳍鱼纲(Actinopterygii)中24科、28属、40种共71个濒危脊椎动物样本为研究对象,进行PCR扩增并对扩增产物进行纯化、测序和基因序列分析。结果显示:建立的检测方法灵敏度可以达0.001 ng/μL,其中62个(39个物种)样本扩增成功,57个样本(34个物种)测序结果与GenBank数据库中的参考序列具有较高相似度,可以鉴定到种的水平。测序所得的基因序列与参考序列的种内遗传距离为0~0.5%、种间遗传距离为1.0%~39.9%,最小种间遗传距离大于最大种内遗传距离,即存在明显的条形码间隔;另外5个样本(5个物种)测序结果在属内种间高度一致,只能鉴定到属的水平。基于16S rRNA基因片段构建的条形码可对濒危脊椎动物进行种属鉴定,可为濒危物种保护、打击非法走私等提供技术支撑。

摘要：将重组酶介导等温扩增技术(RAA)与成簇的规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白12a(CRISPR-Cas12a)检测系统相结合,针对白斑综合征病毒(WSSV)建立快速、灵敏、特异的DNA内切酶靶向CRISPR反式报告(DETECTR)检测系统。针对WSSV保守基因设计RAA引物与crRNA,通过实验筛选最优组合和最佳反应条件,构建WSSV DETECTR检测系统。对该系统进行灵敏度与特异性测试,与WOAH推荐的Real-timePCR和NestedPCR检测方法比较。结果显示,WSSV DETECTR检测系统最低检出限为10copies/μL,灵敏度与Real-time PCR、Nested PCR检测方法相当(均为3.34×10^(1)copies/μL),与其他病原之间无交叉反应,与Real-time PCR、Nested PCR对临床样本的检测结果相一致。结果表明,建立的WSSV DETECTR检测系统具有快速简单、灵敏、特异等优点,为白斑综合征病毒的快速检测提供了新的方法。

摘要：根据传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)基因序列的保守区域设计并合成多组RPA引物和特异性crRNA,经过筛选与优化,建立RPA-Cas12a系统荧光检测法和试纸条法2种可视化快速检测IHHNV的方法。结果显示,这2种可视化检测方法在37℃恒温反应40 min可检测出IHHNV;与对虾白斑综合征病毒、虾肝肠胞虫和十足目虹彩病毒1无交叉反应;该方法灵敏度较高,最低检测浓度为10 copies/μL;应用该方法对10份IHHNV阳性临床样本进行检测,阳性检出率为100%。综合结果表明,建立的荧光法和试纸条2种可视化检测IHHNV的方法操作简单,反应灵敏,适用于对虾养殖场或基层实验室对IHHNV的定期监测和初筛。

摘要：目的建立一种基于数字微流控RT-qPCR芯片技术的上呼吸道易感病毒多靶标快速检测方法。方法根据新型冠状病毒(2019-nCOV)、甲型流感病毒(FluA)、乙型流感病毒(FluB)、冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)的保守区域,设计特异性引物和检测探针,通过将引物和探针预存到数字微流控芯片中,建立检测上述5种上呼吸道病毒的数字微流控RT-qPCR芯片检测技术;评价预存了引物的数字微流控RT-qPCR芯片的检测下限和特异性;使用20例临床样本以PCR仪检测结果作为对照组评价数字微流控RT-qPCR芯片的检测性能。结果建立的2019-nCOV、FluA、FluB、SARS-CoV、MERS-CoV的数字微流控RT-qPCR芯片检测下限为12拷贝/反应,而未使用数字微流控的RT-qPCR法检测下限为15拷贝/反应,两个方法的检测下限基本一致。对于临床样本提取的核酸样品,数字微流控RT-qPCR芯片检测结果均是阴性无非特异性扩增。同时使用RT-qPCR法和数字微流控RT-qPCR芯片法对20例临床样本分别进行5个项目的临床对比测试,共100个测试,结果显示为数字微流控RT-qPCR芯片灵敏度达94%,特异性为100%。使用SPSS对两个方法进行一致性分析,结果显示为两个方法具有高度的一致性(Kappa=0.962,P<0.05)。结论基于数字微流控RT-qPCR芯片技术建立了上呼吸道易感病毒多靶标快速检测方法,为临床早期鉴别呼吸道病原体提供了新的检测手段。