摘要：以油菜品系甘蓝型油菜宁RS-1为植物材料,以南京油菜田里收集的核盘菌为致病菌,根据已经报道的油菜PGIP基因序列,设计简并引物。从宁RS-1基因组DNA中经PCR克隆到1条包含1个内含子与2个外显子的基因序列。序列比对分析显示,该基因与已公布的油菜PGIP1基因的核苷酸序列和氨基酸序列同源性均达99%,编码区序列全长984 bp,编码332个氨基酸,富含亮氨酸。以翻译延伸因子EF-1α作为内标,利用半定量RT-PCR分析了BnPGIP基因在核盘菌未诱导和诱导后宁RS-1中的表达量差异。结果发现,核盘菌诱导后宁RS-1中的BnPGIP表达含量明显提高,表明宁RS-1在受到核盘菌侵染后体内的BnPGIP基因受到诱导表达。为进一步研究BnPGIP基因在抗核盘菌侵染的作用,构建了BnPGIP基因过量表达载体。

摘要：W-4是通过农杆菌介导法将fad2基因的反向重复序列表达框转入甘蓝型油菜Westar后获得的转基因高油酸油菜品系。本研究应用温度不对称PCR(TAIL-PCR)技术扩增获得转基因油菜W-4的T-DNA插入位点的左、右旁侧序列。其中右边界旁侧序列长度为290 bp,其碱基组成G+C含量为31.27%、A+T含量为68.73%;左边界旁侧序列长度为365 bp,其碱基组成G+C含量为32.6%、A+T含量为67.4%,表明该T-DNA整合在富含A/T区。依据左、右边界旁侧序列和转基因载体的T-DNA左右边界序列设计的2对特异性引物TLF/TLR和TRF/TRR,能从W-4基因组DNA中扩增出大小分别为485 bp和405 bp预期产物,而在其他转基因油菜、非转基因油菜的基因组DNA和空白对照中均无特异性扩增产物,据此建立了W-4的转基因事件特异性PCR检测技术。应用该检测技术可以从含有0.1%W-4基因组DNA的混合样品中扩增出特异产物,检测灵敏度达到0.1%。表明应用该技术可对W-4转基因事件进行特异性检测。

摘要：采用基因芯片技术,从油菜中鉴定了一个油分积累优势表达基因即丙酮酸激酶(Pyruvate kinase,PK)基因。为构建甘蓝型油菜PK基因的RNA干扰(RNAi)载体,通过设计引物克隆了PK基因长498 bp的siRNA靶序列,连接到pEASY-T1载体上,采用Not I和Xho I酶切,酶切产物连接到RNAi平台载体pHurricane的Not I和Xho I位点,通过多重PCR鉴定证实载体构建成功,然后将上述PK基因反向重复框克隆到加入napin启动子的pCAMBIA1390表达载体相应的酶切位点上,构建具有种子特异性表达的PK基因的RNAi载体。限制性内切酶酶切证实载体构建成功,为进一步研究PK基因参与决定油菜油分积累的分子机理和代谢调控奠定了基础。

摘要：W-4是通过农杆菌介导法将fad2基因的反向重复序列表达框转入甘蓝型油菜Westar后获得的转基因高油酸油菜品系。为建立W-4的转基因事件特异性PCR检测技术,应用温度不对称PCR(TAIL-PCR)扩增获得转基因油菜W-4的T-DNA插入位点的左、右旁侧序列。其中右边界旁侧序列长度为290 bp,其碱基组成G+C含量为31.27%、A+T含量为68.73%;左边界旁侧序列长度为365 bp,其碱基组成G+C含量为32.6%、A+T含量为67.4%,表明该T-DNA整合在富含AT区。序列比对结果发现,该转基因事件中,T-DNA左边界序列完全整合到油菜基因组中,仅有1个碱基由G转换成了A。而右边界则缺失了包括RB border在内的62个碱基。结果表明:转基因高油酸油菜T-DNA的整合是一次无载体序列的整合。依据左、右边界旁侧序列和转基因载体的T-DNA左右边界序列设计了2对特异性引物TLF/TLR和TRF/TRR,能从W-4基因组DNA中扩增出大小分别为485和405 bp的预期产物,而在其他转基因油菜、非转基因油菜的基因组DNA和空白对照中均无特异性扩增产物,据此建立了W-4的转基因事件特异性PCR检测技术。应用该检测技术可以从含有0.1%W-4基因组DNA的混合样品中扩增出特异产物,检测灵敏度达0.1%。可对W-4的转基因事件进行特异性检测。

摘要：采用基因芯片技术,从油菜中鉴定了一个油分积累优势表达基因即丙酮酸激酶(Pyruvate kinase,PK)基因。为构建甘蓝型油菜PK基因的RNA干扰(RNAi)载体,通过设计引物克隆了PK基因长498 bp的siRNA靶序列,连接到pEASY-T1载体上,采用NotI和XhoI酶切,酶切产物连接到本课题组新近改造的RNAi平台载体pHurricane的NotI和XhoI位点,通过多重PCR鉴定证实载体构建成功,然后将上述PK基因反向重复框克隆到加入napin启动子的pCAMBIA1390表达载体相应的酶切位点上,构建具有种子特异性表达的PK基因的RNAi载体。限制性内切酶酶切证实载体构建成功,为进一步研究PK基因参与决定油菜油分积累的分子机理和代谢调控奠定了基础。

摘要：M342是利用EMS诱变定向选育获得的甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂新种质。通过M342抗性基因与敏感型油菜的ALS基因序列分析结果表明,M342的BnALS3基因存在1处SNP突变,导致编码的蛋白质第556位色氨酸突变为亮氨酸,该突变导致基因序列对BsrD I内切酶消化的差异。为此设计了8条引物,从中筛选到引物对SU54F/SU58R在不同油菜品种中可以特异性扩增出目的片段,该片段经BsrD I酶切分型正确,从而开发了检测M342中抗性基因BnALS3R的CAPS标记。运用该标记对除草剂敏感型油菜、纯合抗性油菜及杂合抗性油菜BnALS3的基因型进行验证,并应用该标记对F_2、BC_1分离群体进行检测。结果表明,该标记验证的基因型结果与测序结果一致。F_2分离群体有Als3Als3、Als3als3、als3als3 3种基因型,BC_1分离群体有Als3als3、als3als3 2种基因型,与表型鉴定结果一致,遵循单基因遗传分离规律,表明该标记可以应用于抗性基因的检测。CAPS标记的获得为抗除草剂油菜的分子标记辅助选择育种奠定了基础。