摘要：从家蚕品种Ｃ１０８和大造后部丝腺提取的基因组ＤＮＡ，用ＰｓｔⅠ酶解后与自己设计的人工接头相连，并用与人工接头序列相匹配的选择性引物进行选择性ＰＣＲ扩增（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）．扩增产物经琼脂糖电泳检测显示，用ＳＡＤＦ法在两品种中能检测到稳定的ＤＮＡ多态性片段．

摘要：微孢子虫(microsporidia)长期专性细胞内寄生,其基因组表现出显著的减缩性。利用家蚕微孢子虫(Nosema bomby-cis)基因组数据库探究在其显著减缩的基因组中是否有编码序列发挥调控序列的作用,结果发现在DNA转录调控中发挥重要作用的细胞分裂周期蛋白(cell division cycle protein)的N端编码序列具有典型的真核生物启动子序列特征。设计引物扩增该基因N端590 bp包含启动子基序的序列(C启动子序列),将该启动子序列克隆到载体启动子(MET25-P)被终止序列(CYC1-T)替代的pUG35载体上,构建由该启动子序列启动下游绿色荧光蛋白(GFP)表达的克隆载体ΔpUG35-CYC1-T-C-yEGFP-CYC1-T,并将其电击转化酿酒酵母***2菌株,经筛选及诱导培养后,在荧光显微镜下观察到酵母中有GFP表达,证实了家蚕微孢子虫细胞分裂周期蛋白的N端编码序列包含具有启动子活性的序列,表明家蚕微孢子虫基因组减缩后,部分编码序列可能扮演了调控序列的角色。研究结果也为微孢子虫启动子的活性验证提供了一个简便的途径。

摘要：【目的】从健康桑树内生菌中分离获得对桑疫病病原菌(Pseudomonas syringae ***)具有显著拮抗作用的菌株,优化其产生抑菌活性物质的发酵条件,为其生防利用奠定基础。【方法】从严格表面消毒的桑树根茎中分离内生菌,采用平板划线法纯化内生菌,用抑菌圈法筛选拮抗菌;根据菌株的形态与培养特征、生理生化特性、16S rDNA序列分析对其进行鉴定。通过单因素试验和正交设计试验优化培养基组分及发酵条件。【结果】从健康桑树中分离获得内生菌77株,其中,编号为SWg2的菌株对桑疫病病原菌具有强而稳定的抑制作用。菌株SWg2的形态与培养特征、生理生化特性和泛菌属(Pantoea sp.)相符,而16S rDNA序列分析结果显示它与成团泛菌(***)的亲缘关系接近。研究表明其最佳发酵配方和培养条件为:甘油(2.00%)、硝酸铵(2.00%)、KH2PO4(0.10%)和MgSO4·7H2O(0.15%),起始pH为7.5,装瓶量20 mL/100 mL,最适培养温度为28℃,转速为170 r/min,种子液接种量为4%,摇瓶培养5 d。【结论】经鉴定,对桑疫病病原具拮抗作用的桑树内生菌SWg2为成团泛菌(***),命名为成团泛菌SWg2。对其发酵条件进行优化后对桑疫病病原菌显示出更强的拮抗作用。

摘要：基于家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)基因组中发现的蓖麻毒素B链(ricin B chain)序列数据设计引物,提取感染Nb第8天的家蚕幼虫中肠组织总RNA,利用RT-PCR方法扩增出RBL463-4基因,并将其克隆进毕赤酵母表达载体pPICZα-A中,构建重组酵母表达载体pPIC-R4。重组质粒pPIC-R4经SacⅠ线性化后,电击导入毕赤酵母X33中,利用博莱霉素(zeocin)筛选获得重组酵母X33/RBL463-4。以2%甲醇诱导表达后,经SDS-PAGE、Western blot检测表达产物,结果出现25kD和20kD2种蛋白,其中25kD蛋白与预测融合蛋白大小一致,表明获得了RBL463-4的融合蛋白。研究结果为进一步探究RBL463-4蛋白在家蚕微孢子虫侵染宿主过程中的功能作用奠定了基础。

摘要：乌拉尔国家金属矿山设计院近年来进行的区域矿井工作情况分析及设计成果表明,整个矿井的工作效果决定于有理论根据的正确选择矿井提升、排水、回采和掘进工作面通风、井筒掘进等过程的机械化方法和手段。本文阐述了改善地下矿山机械设备的一些技术方案,在设计中这些方案基本上是根据发明内容实施的。

摘要：以分离筛选、鉴定的假单胞菌为研究材料,提取假单胞菌的基因组为模板基因,设计引物进行PCR扩增。扩增的条件为94℃预变性4min,98℃变性10s,58℃退火1min,72℃延伸2min,35个循环,72℃复性10min。用试剂盒回收PCR产物,以PGEM-TEasyVector为载体,产生重组质粒,转化到大肠杆菌(***)JM109细胞中,于LB平板上进行蓝白筛选阳性克隆。提取阳性克隆的质粒,电泳筛选滞后质粒,EcoRⅠ酶切验证后进行测序,检测弹性蛋白酶基因在***细胞中的表达。结果表明:PCR扩增出1.67kb的基因片段,并成功克隆在***109细胞中;挑取白斑提取的质粒,检测有滞后质粒,EcoRⅠ酶切检测到3.0kb的载体和1.67kb的基因片段;以滞后质粒为模板再次进行PCR扩增,扩增出1.67kb基因片段,证明该质粒为重组质粒,经上海博亚生物技术公司测序为1.67kb的基因片段,并在***109细胞中表达。

摘要：【目的】人类C型尼曼匹克病(Niemann-Pick disease type C,NPC)主要是由NPC1基因突变引起的一类遗传疾病。NPC1蛋白主要负责胞内胆固醇运输,同时也作为病毒侵染宿主细胞的重要受体之一近年来备受关注。本研究旨在探究NPC1蛋白与中华蜜蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)感染的关系。【方法】通过PCR扩增中华蜜蜂Apis cerana cerana AcNPC1基因;将其克隆至pET-30a原核表达载体,转化至大肠杆菌Escherichia coli Rosetta TM(DE3)进行IPTG诱导表达,采用镍柱纯化重组蛋白,免疫小鼠制备多克隆抗体。设计并合成AcNPC 1 siRNA,添食中华蜜蜂幼虫;运用RT-qPCR检测和分析中华蜜蜂CSBV添毒幼虫中AcNPC1的表达量,以及RNAi干扰后不同时间AcNPC1基因和CSBV病毒衣壳蛋白VP1基因在感染CSBV的中华蜜蜂幼虫中的表达水平。【结果】成功构建重组表达质粒pET-30a-AcNPC 1,在大肠杆菌中获得高效表达的重组蛋白,目的蛋白大小约为36 kD,经亲和纯化获得了纯度较高的重组蛋白,免疫小鼠成功制备了多克隆抗体,免疫印迹分析发现AcNPC1抗体能杂交到两条带,有可能是在提取膜蛋白过程中该蛋白发生了部分降解。中华蜜蜂CSBV添毒幼虫中AcNPC1表达与正常幼虫中的相比,在12,24和48 h并无显著变化,在72 h出现显著上调。RNAi实验结果表明,中华蜜蜂正常幼虫添食24 h后AcNPC1的3个干涉片段(siRNA1,siRNA2 and siRNA3)均对AcNPC 1具有显著性下调作用,AcNPC1表达分别下调了73.20%,72.81%和54.78%;给CSBV添毒幼虫分别添食3个干涉片段,AcNPC1表达分别下调了43.90%,59.85%和57.67%。CSBV VP1基因在干扰AcNPC1基因72 h后表达下调了67.65%。【结论】利用原核表达系统能有效地在体外表达中华蜜蜂AcNPC1,并制备了其多克隆抗体。利用体外合成的siRNA对中华蜜蜂幼虫中AcNPC1的表达进行干扰,表明在蜜蜂中通过饲喂的方式进行RNAi可以成功下调靶标基因表达水平。不过,RNAi实验结果提示AcNPC1表达下调后可能并不直接影响CSBV的感染。本研究为进一步阐明AcNPC1的潜在功能打下了基础。

摘要：家蚕由野桑蚕驯化而来,而野桑蚕sericin1及其上游调控序列的相关研究较少。本研究以家蚕sericin1及其上游调控序列设计引物克隆野桑蚕sericin1及其上游调控序列,将克隆得到的野桑蚕Sericin 1序列翻译后用muscle软件与家蚕Sericin 1蛋白序列比对,结果表明预测的野桑蚕Sericin 1氨基酸序列与家蚕Sericin 1 A′(Ser1 A′)氨基酸序列相似性很高,达98%。野桑蚕丝胶1基因上游调控序列与家蚕一样也存在多态性,克隆得到了1061bp和636bp的两条序列,中间存在425bp的插入序列,与家蚕丝胶1基因上游调控序列相似性分别为98%和97%。

摘要：为了保证在地表以下160～230m深处爆破震中上部地表住宅区建筑物的爆破地震安全,取作为其主要准则的土体移动逮度不超过1cm/s。研究结果证实,地震波沿岩石层理传到地表的那些地点的土体移动速度为其它地点的1.5～1.9倍,而沿基岩断口传至地表的那些地点的地震强度为其它地点的1.3～1.4倍。提出了微差起爆时1段延期的容许药量和瞬发起爆时容许药量的计算公式。

摘要：从家蚕品种 Ｃ１０８ 和大造后部丝腺提取的基因组 Ｄ Ｎ Ａ 用 Ｐｓｔ Ⅰ酶解后与自行设计的人工接头相连，并用与人工接头序列相匹配的选择性引物进行选择性 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增（ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ａｍ ｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ） 。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测显示，用 Ｓ Ａ Ｄ Ｆ 法在两品种中能检测到稳定的 Ｄ Ｎ Ａ 多态性片段，表明此方法可用于分子标记的筛选。经研究发现：当 Ｐ Ｃ Ｒ 反应体系中 Ｍｇ２ ＋ 为１５ ｍ ｍ ｏｌ／ Ｌ，ｄ Ｎ Ｔ Ｐｓ 为２００μｍ ｏｌ／ Ｌ，引物为１μｍ ｏｌ／ Ｌ 时可得到较好的结果；在热循环过程中，以５６ ℃退火为宜；扩增反应对模板 Ｄ Ｎ Ａ 质的要求远胜于量。