摘要：根据GenBank已登录序列中黄瓜多主棒孢琥珀酸脱氢酶B亚基(SdhB)基因序列差异,针对SdhB-H278Y突变设计特异性引物,建立SdhB-H278Y突变实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测体系。结果表明:供试多主棒孢携带SdhBH278Y、SdhB-I280V突变;SdhB-H278Y突变株对啶酰菌胺抗性较强,EC50值为21.47μg·mL^(-1)或>30μg·mL^(-1);建立的real-time PCR检测体系具有良好的线性关系,相关系数R2=0.9929,可特异性检测SdhB-H278Y突变,灵敏度为3.6×10^(-4) ng·μL^(-1),为AS-PCR的10倍。利用携带SdhB-H278Y突变不同比例的基因组DNA对检测体系进行验证,预期值与检测值具有很高的相关性,R^(2)=0.9997;利用该检测体系对山东地区黄瓜棒孢叶斑病病斑中多主棒孢SdhB-H278Y突变株所占比例进行检测,检测结果为0.12%~2.69%。综上,本试验建立的real-time PCR检测体系高效、灵敏、定量,可用于多主棒孢SdhB-H278Y突变的检测,为黄瓜棒孢叶斑病抗性治理提供技术支持。

摘要：目的构建靶向CD74基因的小发夹RNA慢病毒载体,感染胰腺癌Capan-2细胞株,筛选并建立稳定细胞株。方法应用q RT-PCR法检测不同胰腺癌细胞株间CD74的m RNA表达情况;根据Gene Bank提供的CD74 c DNA序列,设计3条靶向CD74的si RNA序列,构建重组干扰质粒p SUPERretro-puro-CD74-si RNA;将重组干扰质粒转染Capan-2细胞,经过q RT-PCR和Western blot法筛选出最佳干扰效果质粒;慢病毒包装质粒并感染Capan-2细胞株,利用嘌呤霉素筛选,建立稳定低表达CD74细胞株;应用q RT-PCR和Western blot法检测CD74基因m RNA和蛋白的表达抑制率。结果 Capan-2细胞株的CD74 m RNA平均ΔCt值为102.9±6.4,在各胰腺癌细胞株中表达水平最高(P<0.05);携带干扰效果最高si RNA的慢病毒感染Capan-2细胞,建立了稳定低表达CD74基因的Capan-2细胞株,CD74基因m RNA抑制率61%,蛋白抑制率90%。结论成功筛选出靶向CD74的sh RNA最佳干扰质粒,构建了CD74-RNAi慢病毒载体,并稳定感染建立了低表达CD74基因的Capan-2细胞株。