摘要：目的·构建反转录病毒小向导RNA(small guide RNA,sgRNA)表达载体,用于小鼠T细胞分化调控及其基因功能的研究。方法·表达短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)的反转录病毒载体(MSCV-LTR-miR30-PIG,LMP)经过Xho1和Sal1双酶切后,回收得到反转录病毒载体骨架。以慢病毒sgRNA表达载体为模版,通过PCR扩增获得U6-sgRNA-PGK-Puro-BFP片段。利用同源重组将U6-sgRNA-PGK-Puro-BFP片段组装进反转录病毒载体骨架。为了验证系统的有效性,设计靶向Il17a、Rorc和Irf4的sgRNA序列并进行克隆。分离Cas9转基因小鼠CD4 T细胞分别进行sgRNA反转录病毒感染,诱导其向Th17细胞分化。细胞因子染色,流式检测Il17a阳性细胞比例。2组独立样本数据比较采用非配对t检验。结果·①成功构建反转录病毒sgRNA载体。②利用反转录病毒载体向小鼠CD4 T细胞递送sgRNA并实现Il17a基因敲除。③Rorc-sgRNA和Irf4-sgRNA阳性群体中,Il17a阳性群体比率显著降低(P<0.05)。结论·利用sgRNA反转录病毒载体成功向目的细胞递送sgRNA并实现基因敲除。Rorc和Irf4基因敲除结果提示该系统可用于小鼠T细胞基因功能研究。

摘要：目的·以全基因组关联研究报道的系统性红斑狼疮相关单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点rs1978421为例,利用规律成簇间隔短回文重复序列/相关蛋白9[clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR associated protein 9,CRISPR/Cas9]系统建立非编码区疾病相关的遗传突变位点功能的研究策略。方法·针对SNP rs1978421位点设计单链导向RNA(single guide RNA,sgRNA),利用T7核酸内切酶Ⅰ(T7 endonucleaseⅠ,T7EⅠ)实验在HEK293T细胞中验证sgRNA对靶点的切割效率。以电穿孔转染的方式将融合Cas9-绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)和sgRNA的表达质粒及同源重组的模板转染至U-937细胞内,通过流式分选得到单个的GFP阳性U-937细胞,培养14 d后进行基因型鉴定。筛选得到同源重组的细胞克隆后,通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)对rs1978421上下游2 Mbp范围内的基因及miR-146a进行定量,分析rs1978421不同等位基因对miR-146a及其周围基因的表达影响。结果·T7EⅠ实验表明,约有24%的HEK293T细胞中的rs1978421位点发生切割。在U-937细胞内进行的同源重组实验中,共计得到141个细胞株;其中6个同源重组成功,成功率为4.3%。qPCR结果显示,在野生型TT与同源重组成功CC的U-937细胞中,miR-146a及所检测基因的表达情况均无显著变化(均P>0.05)。结论·SNP rs1978421对其周围2 Mb范围内的基因及miR-146a并无调控作用,但该研究证明了CRISPR介导的同源重组技术用于非编码区SNP位点功能研究的可行性。

摘要：目的·结合Dox诱导型单链导向RNA(single guide RNA,sgRNA)表达载体和Cas9转基因小鼠,构建诱导型CRISPR/Cas9系统用于小鼠免疫细胞基因功能研究。方法·根据四环素诱导表达系统原理,基因合成U6-TetO-sgRNA和EF1α-T2A-Puro-BFP-T2ATetR片段。通过同源重组将2个片段组装进反转录病毒载体骨架,获得Dox诱导型sgRNA反转录病毒载体。为了验证系统有效性,分离Cas9转基因小鼠骨髓细胞并诱导其向巨噬细胞方向分化。设计对照(non-targeting control,NC)组和实验组(靶向F4/80)的sgRNA,利用反转录病毒感染细胞,分化条件设置添加Dox组(Dox^(+))和不添加Dox组(Dox^(-))。通过流式细胞术和T7核酸内切酶Ⅰ(T7 endonucleaseⅠ,T7EⅠ)实验检测基因敲除效果。结果·①成功构建Dox诱导型sgRNA反转录病毒表达载体和Cas9转基因小鼠。②流式结果显示,在NC Dox^(-)组、NCDox^(+)组和F4/80 Dox^(-)组中,几乎无F4/80阴性细胞群体;而在F4/80 Dox^(+)组中,F4/80阴性细胞群体高达50%。③T7EⅠ结果显示,在F4/80 Dox^(-)组中,DNA条带完整,而在F4/80 Dox^(+)组中发生基因突变,DNA条带被切开。结论·结合Dox诱导型sgRNA表达载体和Cas9转基因小鼠,成功构建诱导型CRISPR/Cas9系统。利用该系统成功在小鼠免疫细胞中实现可诱导性基因敲除。