摘要：目的利用慢病毒介导构建磷酸二酯酶7A(PDE7A)基因沉默人单核巨噬细胞(THP-1)株,并分析沉默细胞株的三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)的表达变化。方法以PDE7A基因为靶点,设计合成3段sh RNA片段,与慢病毒载体Pmi Rzip连接,构建重组质粒。测序鉴定后进行病毒包装,感染THP-1细胞,实时荧光定量聚合酶链反应(q PCR)进行分析,确定最佳干扰片段。嘌呤霉素筛选得到PDE7A基因沉默稳转细胞株。q PCR和Western blot检测鉴定所构建的细胞株,将其诱导成为泡沫细胞后鉴定ABCA1基因的表达。结果转染sh RNA1、sh RNA2、sh RNA3细胞的PDE7A相对表达量分别为(0.480±0.028)、(0.561±0.016)和(0.377±0.013),故选择sh RNA3作为干扰PDE7A基因的最佳片段。采用1.4 g/L嘌呤霉素成功筛选出PDE7A沉默细胞株,q PCR和Western blot检测PDE7A基因的干扰效率,其抑制效率>70%。将其诱导成巨噬泡沫细胞后,Western blot检测显示,ABCA1的表达量增加40%。结论成功构建PDE7A sh RNA慢病毒干扰载体,并筛选出PDE7A基因沉默的THP-1细胞株,且ABCA1的表达量增加。

摘要：目的观察腺苷酸环化酶AC1和AC4对泡沫细胞胆固醇流出的影响。方法以人AC1和AC4基因为靶点,设计合成sh RNA寡核苷酸片段,插入慢病毒载体p GMLV-SC1,构建重组慢病毒载体。用构建的AC-sh RNA慢病毒感染THP-1细胞,q PCR检测干扰载体对AC1和AC4基因的干扰效果。慢病毒感染泡沫细胞后,采用液体闪烁计数法测定apo A-1介导的泡沫细胞胆固醇流出率。结果测序结果表明,AC1和AC4基因的sh RNA寡聚核苷酸序列已成功插入慢病毒载体。荧光观察显示,两种慢病毒的感染效率达80%。q PCR分析表明,AC1-sh RNA和AC4-sh RNA干扰载体对靶基因有明显的抑制效果(P<0.01),其抑制效率分别为83.9%和80.1%。AC1和AC4-sh RNA慢病毒感染泡沫细胞后,胆固醇流出明显降低(P<0.01)。结论本实验初步证实AC1和AC4可降低泡沫细胞胆固醇流出,提示其可能在胆固醇代谢中起作用。