摘要：目的:建立检测与鉴定布鲁氏菌A19疫苗株基因组DNA的巢式PCR方法。方法:通过全基因组序列比较,分析布鲁氏菌A19疫苗株与其他布鲁氏菌全基因组序列的差异位点,依据差异位点设计引物,建立检测与鉴定布鲁氏菌A19疫苗株基因组DNA的巢式PCR方法。提取布鲁氏菌A19疫苗株基因组DNA,倍比稀释后作为模板DNA,应用建立的巢式PCR方法进行灵敏性测试;同时,应用建立的巢式PCR方法检测除布鲁氏菌A19疫苗株之外的其他布鲁氏菌及非布鲁氏菌菌株基因组DNA,进行特异性测试。结果:建立的巢式PCR方法检测布鲁氏菌A19疫苗株基因组DNA最低检出限为3.43 fg,扩增结果显示,出现246 bp电泳条带,其他布鲁氏菌菌株出现314 bp电泳条带,而非布鲁氏菌菌株均未扩增出电泳条带。结论:建立的巢式PCR方法具有灵敏性高、特异性强的特点,反应体系中存在1个拷贝数的布鲁氏菌A19疫苗株基因组DNA,即可检测到,本方法适用于标本中布鲁氏菌A19疫苗株微量基因组DNA的检测与鉴定。

摘要：目的建立一种布鲁氏菌S2疫苗株的实时荧光定量PCR检测体系。方法依据布鲁氏菌S2疫苗株与其他布鲁氏菌参考菌株全基因组序列的差异,设计引物和探针,建立实时荧光定量PCR检测体系。自中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,收集22株布鲁氏菌参考菌株及8种非布鲁氏菌对照菌株的DNA;同时自布病疫苗生产厂采集环境样本,使用血液/组织基因组DNA提取试剂盒提取环境样本细菌DNA。对获取的DNA先行普通PCR预扩增,再以扩增的PCR产物为模板进行实时荧光定量PCR二次扩增(巢式荧光定量PCR),观察是否出现特异荧光曲线及相应的循环数(Ct值),并测试其灵敏性。结果建立的实时荧光定量PCR检测体系,除S2疫苗株外,其他21株布鲁氏菌参考菌株和8种非布鲁氏菌对照菌株均未检出特异荧光曲线(无Ct值)。建立的检测体系,检测布鲁氏菌S2疫苗株DNA的最低限为4.34 fg;采集的14份环境样本,其中3份检测到布鲁氏菌S2疫苗株DNA。结论建立的实时荧光定量PCR检测体系,能够检测到样本中布鲁氏菌S2疫苗株,具有较好的灵敏性和特异性。