摘要：目的克隆家蝇抗真菌肽-1(MAF-1)的cDNA序列并对其编码的蛋白序列进行生物信息学分析。方法根据MAF-1的N端30个氨基酸序列设计简并引物,采用RACE法和巢式PCR技术克隆MAF-1的3′端和5′端cDNA序列,获得MAF-1的cDNA序列和氨基酸序列。根据所得MAF-1成熟肽部分的cDNA序列设计引物进行RT-PCR,对序列进行验证并运用生物信息学软件进行分析。结果 MAF-1的3′端cDNA序列长度为568bp,开放阅读框长度为441 bp,编码蛋白序列共147个氨基酸,3′端非编码区127bp。经NCBI中Blast比对未找到同源序列,提示该基因为一全新序列,登录到GenBank,获得登录号HM178948。该基因编码的147个氨基酸加上MAF-1的N端未用来设计引物的9个氨基酸,全长共156个氨基酸。由5′RACE获得139 bp cDNA序列,分析所得MAF-1成熟肽的氨基酸序列与前述一致。RT-PCR结果证实了RACE所得MAF-1序列的正确性。根据生物信息学分析方法对所推导的MAF-1蛋白全长序列进行分析,其理论相对分子质量和等电点均与其实际检测值相近。利用ExPASy的各种分析工具对MAF-1分析得知,该蛋白具有信号肽,富含α螺旋,有3个α螺旋区,亚细胞定位分析其主要分布于细胞核内。利用PredictProtein分析发现,MAF-1序列中有2个蛋白激酶C磷酸化位点、1个N端酰基化位点,并预测MAF-1为非球形蛋白。最后,利用ExPASy中的3D-pssm(Phyre Version0.2)模建了MAF-1的三维空间结构图。结论成功克隆了家蝇抗真菌肽-1(MAF-1)的cDNA序列,获知其编码的氨基酸序列和生物信息学信息。

摘要：民以食为天,随着食品资源的大力开发和食品生产规模的不断扩大,生态污染的日益严重,食品安全事件频发,食品安全问题已成为社会关注的共同问题。两会上,对食品安全问题,国家主席习近平强调要牢固树立以人民为中心的发展理念,加快完善统一权威的监管体制和制度,提出并落实最严谨的标准、最严格的监管、最严厉的处罚、最严肃的问责＂四个最严＂的要求,切实保障人民群众＂舌尖上的安全＂。

摘要：克隆家蝇内源性β-葡萄糖苷酶(beta-glucosidase,BG)基因,建立两种原核表达体系和一种真核表达体系,分别检测表达产物的活性,比较不同表达体系对其表达水平及重组蛋白酶学性质的影响,为进一步研究和利用家蝇BG酶奠定基础。本研究根据BG酶基因的cDNA序列设计引物扩增BG酶基因成熟肽的基因片段,分别采用表达载体pET-28a(+)和pEGX-4T-1构建原核表达体系并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。在65 kDa附近均出现特异性蛋白条带,进行Western Blotting鉴定证实重组质粒在其宿主菌*** BL21(DE3)中成功表达,命名为MDBG-1蛋白和MDBG-2蛋白。同时选用真核表达载体pPICZa A构建酵母分泌型表达体系在酵母细胞GS115中获得稳定的表达,将其命名为MDBG-3蛋白。采用七叶苷平板法和DNS法对三种表达体系所重组表达的蛋白进行酶活性鉴定和检测,显示3种表达体系所表达的融合蛋白均具有BG酶活性,其酶活力有所不同,且真核表达体系所表达的蛋白酶活性最高。本研究对家蝇β-葡萄糖苷酶基因表达的重组蛋白特性进行初步研究,为发现新的有效纤维素酶体系提供基础数据。

摘要：几丁质酶是昆虫几丁质降解过程中的重要酶类,在昆虫整个生长发育过程中发挥着重要作用.为筛选及挖掘与防治有害医学昆虫相关的分子靶标,根据家蝇几丁质酶2(Musca domestica chitinase 2,MdCht2)基因序列设计并合成双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA),采用微量注射法向家蝇2龄幼虫导入dsRNA,对对照组及干扰组的样本进行转录组测序,筛选差异表达基因,进行GO(gene ontology)功能注释和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析.结果显示,注射dsRNA 24 h后,幼虫MdCht2 mRNA的表达显著下降,提示导入的dsRNA干扰了MdCht2的表达.经转录组测序,与对照组相比,显著差异基因共213条,其中78条基因为上调表达,135条基因为下调表达.随机选取8条显著差异基因通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)进行验证,该结果与转录组结果趋势一致.根据功能注释发现这些差异基因与生长发育、脂类代谢、免疫调控等途径相关.本研究通过RNA干扰和转录组测序技术处理家蝇获得大量差异基因,结果可为后续几丁质酶相关基因的挖掘和鉴定及功能研究提供一定的数据基础.(图7表4参46)

摘要：几丁质酶是昆虫几丁质降解过程中的重要酶类。本研究旨在利用大肠杆菌(Escherichia coli)原核表达系统获得高纯度的MDCht2重组蛋白,并从几丁质酶活性及抗菌活性两方面来初步探讨MDCht2的生物学功能。MDCht2的cDNA序列设计包含酶切位点Eco RⅠ、HindⅢ和6×His标签的引物,以家蝇3龄幼虫的cDNA为模板进行PCR扩增,以pET28a(+)为载体构建重组质粒,并转化到大肠杆菌Transetta (DE3)中,经IPTG诱导,表达产物用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定,利用Ni离子亲和层析技术纯化MDCht2重组蛋白,Western Blot技术及质谱分析鉴定纯化蛋白。以4MU-(GlcNAc)3为底物,测定重组蛋白的酶活性;采用微量液体稀释法分析重组蛋白对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白假丝酵母菌的抗菌活性。成功克隆MDCht2基因,构建了具有正确序列的原核重组表达质粒,将重组质粒导入Transetta(DE3)中,经镍柱纯化获得带His标签的重组MDCht2蛋白,质谱分析显示重组蛋白与MDCht2蛋白序列一致。酶活分析表明,不同浓度的MDCht2重组酶均有几丁质酶活性,呈现一定的量效关系;该重组蛋白的最适pH值为4.0,在pH=8.0时稳定性最好;最适温度为35℃;金属离子和Tris对MDCht2酶活均有抑制作用。抗菌活性结果显示,MDCht2蛋白对金黄色葡萄球菌,大肠杆菌均无抑菌效果,但对白假丝酵母菌有抑制作用,MIC值为225μg/m L,MBC(Minimum bactericidal concentration)值为450μg/mL。本研究成功获得了MDCht 2重组蛋白,体外检测有较强的几丁质酶活性和抗真菌活性,为进一步研究该酶的功能奠定一定基础。

摘要：目的对家蝇热休克蛋白20(HSP20)基因进行生物信息学分析,并进行克隆、表达研究。方法利用美国国家生物技术信息中心和瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统中有关基因和蛋白序列的分析工具,结合其他生物信息学分析软件包,从Gen Bank上家蝇基因组序列识别出编码HSP20的基因,分析预测该蛋白质的结构功能;设计引物PCR扩增HSP20基因,将其克隆到原核表达质粒PEASY-E1中,重组质粒在大肠杆菌Origmi B/DE3中经用异丙硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达,表达产物用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)鉴定。结果 HSP20基因序列全长865bp,最大开放阅读框(ORF)为567bp,编码188个氨基酸,理论分子量为21443.2 Da,等电点为5.96;所构建的重组质粒经PCR、双酶切及测序鉴定成功;SDS-PAGE分析结果显示,重组质粒在Origmi B/DE3中表达并纯化,得到的融合蛋白相对分子质量约为21443.2 Da,诱导12 h蛋白表达量最高,SDS-PAGE法得到的蛋白条带与目的蛋白大小相符。结论成功构建PEASY-E1-HSP20重组原核表达质粒并表达出融合HSP20蛋白,为进一步研究该蛋白的功能奠定基础。

摘要：【目的】探明家蝇β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,BG)在家蝇体内的功能,为深入研究家蝇BG在木质纤维素降解中的作用奠定基础。【方法】针对家蝇BG基因的功能结构域设计3对特异性引物用于dsRNA的体外合成,通过显微注射的方法将dsRNA导入家蝇2龄幼虫,利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测抑制效率,分别以滤纸、水杨苷、微晶纤维素及羧甲基纤维素钠为底物检测BG基因的干扰对家蝇消化道粗酶液滤纸酶活性、BG、CBH(Cellobiohydrolase)及EG(Endoglucanase)酶活性的影响。【结果】在注射dsRNA后18 h家蝇幼虫消化道中BG基因的表达量下降62%且此时为最佳干扰时间点,在BG基因表达受到抑制后家蝇消化道的滤纸酶、BG酶活性显著降低,且时间变化趋势与上述干扰条件下BG基因表达量变化一致,均在干扰后18 h酶活性达最低,但CBH及EG酶活性较对照组无显著变化。【结论】RNA干扰技术能够有效抑制家蝇BG基因的表达,推测家蝇BG具有滤纸酶和BG酶活性。

摘要：[目的]对MDCht9基因进行生物信息学分析,构建原核表达载体,获得重组蛋白,并测其酶学活性。[方法]构建邻位连接树研究MDCht9基因的分类归属及其与黑腹果蝇、冈比亚按蚊和致倦库蚊几丁质酶的进化关系,采用生物信息学软件,分析MDCht9基因及编码蛋白的理化性质,信号肽、二级结构等,预测蛋白质的功能;根据其c DNA序列设计引物,PCR扩增,以p ET28(+)为载体构建重组质粒,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,异丙硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)进行诱导,表达产物用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,质谱鉴定纯化蛋白。几丁质酶活测定:以4MU-(Glc NAc)3为底物,测定重组蛋白的酶学活性。[结果]系统发育树表明MDCht9基因与果蝇Cht9基因同源性最高,其ORF全长1 401 bp,编码466个氨基酸,理论分子量为50 827. 2 Da,等电点为6. 97,属于亲水性蛋白。MDCht9基因编码蛋白的第1-22氨基酸为信号肽,剪切位点位于第22与第23位氨基酸之间。MDCht9蛋白的功能结构域位于第24-357位氨基酸间,是18家族几丁质糖基水解酶的催化域,第413-466位氨基酸之间的序列为几丁质结合区域。MDCht9蛋白的二级结构及三级结构显示有3种类型:以无规则卷曲为主(Cc),其次为α-螺旋(Hh)和β折叠(Ee)。构建了具有正确序列的MDCht9重组表达质粒,重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达;通过亲和层析柱纯化的重组蛋白质谱鉴定,与MDCht9序列一致,提示MDCht9重组蛋白获取成功。酶学活性表明不同浓度的MDCht 9重组蛋白均有几丁质酶活性,而且呈现一定的量效关系,0. 18 mg/m L重组蛋白的4 MU生成量为53. 63 U,0. 045 mg/m L重组蛋白的4 MU生成量为9. 97 U。[结论]采用原核表达系统成功获得MDCht9的重组蛋白,且重组蛋白有较强的酶活性,为进一步研究其功能奠定了基础。

摘要：针对现有三维图样技术在实际应用中存在的主要问题,提出了设计视图、模型与标注分区显示、集成标注等具体方法,解决了目前三维图样信息显示不清晰、无法满足复杂产品信息定义需求等关键问题。结合数字化环境下产品信息表达与数据一致性等需求,采用信息结构树保证了几何与非几何信息间的关联性。给出了三维图样系统的具体设计方案,以及相应可视化功能的具体实现方法,实现了基于ACIS与HOOPS联合平台的三维图样软件系统开发,在该系统中完成了典型零件的精度设计,验证了三维图样软件系统的实用性。

摘要：为获得最优的变压器悬挂参数,基于多激励条件对其参数选择进行研究。首先建立高速列车-变压器耦合系统动力学模型,利用新型快速显示数值积分法求解车辆系统振动响应;然后依据车辆舒适度指标和变压器振动烈度计算结果,探究车辆系统振动指标随变压器悬挂参数变化规律;最后依据变压器悬挂参数对系统振动特性的影响规律确定变压器最佳悬挂参数。研究结果表明:变压器悬挂于中部能明显改善中部舒适度,且悬挂阻尼比对车辆舒适度和设备振动烈度影响不明显;当悬挂频率比大于1.4,车辆舒适度不再随悬挂频率比变化而变化;变压器悬挂频率比为0.9~1.1时,车辆乘坐舒适性和变压器振动水平都有较好的表现。研究成果可以为变压器的最优悬挂参数设计提供指导。