摘要：根据Genebank中发表的犬传染性肝炎病毒 (ICHV)标准强毒株Glaxo和人工驯化的弱毒疫苗株CLL的保守序列间大小不同 ,按照引物设计的原则 ,设计合成了一对通用引物。该对引物可由ICHV强毒株扩增出 569bp的片段 ,而弱毒株可扩增出 2 4 4bp的片段。对PCR产物分别进行电泳、酶切和测序 ,证明PCR产物片段大小、酶切位点和核苷酸序列与设计的产物完全一致。正常DK细胞上清和犬传染性喉气管炎病毒 (CAV 2 )强、弱毒株细胞培养物均不能被该引物扩增 ,说明具有良好的特异性。其检测到的病毒量分别为 1 5TCID50 、 31TCID50 、说明该技术具有很高的敏感性。可用于ICHV强。

摘要：目的:在支原体16SrRNA的种属特异性区域设计一对引物及其相应的Taqman探针,建立荧光定量PCR方法,检测细胞培养物中支原体。方法:选择16srRNA支原体种属特异性区域作为扩增区,设计支原体通用引物,PCR扩增片段的预期大小为288bp。回收PCR扩增产物,连接pMD-18T载体,转化JM109大肠杆菌,涂布Amp+琼脂平板,挑取阳性克隆进行PCR鉴定后提取质粒。构建荧光定量PCR绝对定量的标准品,设计荧光定量引物、探针,采用矩阵法对反应体系进行优化,建立绝对定量的标准曲线。利用十倍稀释法检验灵敏度并与普通PCR法及培养法进行比较;对支原体及其他5种革兰氏阳性杆菌进行特异性检验;对培养法、普通PCR法及荧光定量PCR法检测样本的灵敏度进行比较。结果:支原体PCR产物大小约为288bp,质粒质量浓度为13.9mg·mL-1,A260/A280(Ratio)为1.780,质粒溶液浓度为4.25×109拷贝.μL-1。10μmol.L-1的引物浓度和10μmol.L-1探针浓度为最佳反应浓度,双温循环及60℃退火温度为最佳的循环条件。检测灵敏度为4.250×101拷贝。拷贝数与Ct值之间的线性关系表达式:Ct=-2.916×log拷贝数+40.02。特异性检验中5种革兰氏阳性杆菌样本检测均为阴性,支原体样本为阳性,表明特异性好。准确性检测中变异系数小,表明稳定性好。组内及组间相同浓度样本检测具有相同的Ct值,表明重现性好。样本检验中,荧光定量PCR检测出的阳性样本高于普通PCR及培养法。结论:支原体荧光定量PCR法检测细胞样本及临床样本中支原体快速、特异性强、灵敏度高、稳定性好。

摘要：从重庆某动物园死亡的大熊猫肝脏中分离到一株病毒,经鉴定为犬冠状病毒(命名为CCVDXMV)。本实验根据CCV K378和CCV Insavc-1株基因序列设计合成了普通PCR引物SF1-SR1和SF2-SR2,以及半套式引物SF3-SR3、SRI3、SFI3、SF4-SR4和SFI4,分段扩增了CCV DXMV株部分S基因,得到了368 bp、792 bp、737 bp、1 178 bp和985 bp 5个基因片段。将纯化的RCR产物分别克隆到pGEM-T载体中,通过筛选和鉴定,获得了5个阳性重组质粒。将重组质粒送生物公司测序,将测得的基因序列与先前测定的该株病毒部分S基因序列,拼接成全S基因序列,并与其它株CCV及TGEV HN2002和FIPV 79-1 146株的S基因序列进行分析比较,绘制进化树。结果表明,该株病毒与CCV K378株的同源性最高,达到99.4%;而与CCV 23/03株的同源性最低,为56.9%;与FIPV和TGEV分别有90.4%和82.1%的同源性。

摘要：为构建可用于同源重组或体外重组的犬腺病毒 (canim e adenovirus,CAV) E3区缺失性表达载体 ,在克隆的 E3区两末端设计并合成了 2对突变引物 ,在引物中分别引入 1个 Bgl 酶切位点 ,以 p BE3质粒为模板 ,经 2次点突变后 ,得到含有 2个 Bgl 位点的重组质粒 p BE3M。该质粒经 Bgl 酶切后自连得到 E3区缺失的质粒 p BE3Δ。在 p BE3Δ质粒的 Bgl 位点加入接头后 ,产生含多个酶切位点的质粒 p BE3L,经相应的酶切鉴定 ,证明突变、缺失和接头连接正确后 ,利用 p BE3L 分别构建了带有和不带有外源性启动子的绿色荧光蛋白基因的重组表达质粒 ,并分别进行转染以检测其表达。结果显示 ,p BE3L CGFP质粒在转染 DK细胞后 ,于 36 h即可观察到荧光 ,72～ 96 h无明显差别 ,传 3代后仍可见表达荧光的细胞 ;而 p BE3L GFP质粒转染 DK细胞后经检测无表达。结果表明 ,构建的 E3区缺失性载体不能利用 E3区自身的启动子进行目的基因的表达 ,外源性启动子的加入是必要的。

摘要：为研究犬瘟热病毒（ＣＤＶ）融合蛋白各段功能，根据ＣＤＶＯｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ弱毒株的融合蛋白基因序列，设计合成了１０条寡聚核苷酸引物。对此１０条引物进行不同的配对，将１株犬瘟热疫苗弱毒株细胞培养物的总ＲＮＡ进行ＲＴ－ＰＣＲ扩增，利用１次ＰＣＲ扩增得到了７个基因片段，最长的达１６６９ｂｐ，最短的为３１４ｂｐ；应用套式或半套式ＰＣＲ。

摘要：根据本室分离获得的虎源H5N1流感病毒的HA基因序列测定结果。结合GenBank中报道的H5亚型禽流感病毒HA基因序列进行同源性比较分析。选择保守序列区作为扩增区域，利用Primer5．0引物设计软件和BLAST软件程序设计出特异性扩增引物。采用成本较低、不需要特异探针引物、优化周期短。能区分病毒变异株的SYBR GreenⅠ随机掺入法建立定量PCR反应体系，并对反应条件进行优化。试验结果表明应用该方法对虎源H5流感病毒的检测具有高度的特异性，检测的灵敏度为10^1-10^2拷贝数。对20份病死老虎临床病料和24份人工感染的小鼠脏器病料用荧光定量RT-PCR方法、常规RT-PCR方法和病毒分离方法进行检测。荧光定量RT-PCR方法检测结果略高于常规RT-PCR方法，但与病毒分离方法结果相一致。这说明荧光定量RT—PCR方法可以对临床上H5N1虎源流感病毒检测提供参考。

摘要：根据肉食兽细小病毒核苷酸序列高度同源的特点 ,设计合成了 1对引物 ,以犬细小病毒、貂肠炎病毒和猫泛白细胞减少症病毒细胞培养物为 DNA模板 ,进行 PCR特异性片段扩增 ,扩增片段大小为 0 .6kb。结果表明 ,扩增产物与设计的 2个引物之间的序列大小一致。通过通用性、特异性与敏感性试验及对临床送检样品检测 ,证明本法对肉食兽细小病毒通用 ,且具有快速、特异和高度敏感的特点。

摘要：根据GenBank报道的犬腺病毒(CAV)和犬细小病毒(CPV)序列,设计两对联合PCR引物,其中一对为CAV-1和CAV-2通用引物,另一对为CPV引物。在建立单项PCR基础上,通过优化Mg2+离子浓度和循环参数等反应条件建立联合PCR,确定联合PCR条件为:96℃180s,96℃30s,56℃30s,72℃80s,30个循环。联合PCR结果显示:CAV-1扩增片段大小为497bp,CAV-2为1019bp,CPV为719bp;细胞和其它相关病毒对照均无扩增带。上述PCR产物经用限制性内切酶酶切和克隆测序,结果均与相应病毒的应有条带和序列相同。敏感性比较试验结果表明,联合PCR比用细胞培养分离病毒敏感。将联合PCR应用于15份CAV和CPV细胞培养物,5份CAV-1、1份CAV-2和3份CPV人工感染犬病料以及30份临床病料检测,并与电镜负染、HA/HI及病毒分离等方法的结果进行比较,结果显示,联合PCR的检出率和病毒分离结果一致,高于电镜负染和HA/HI试验。以上结果说明:CAV-1/CAV-2和CPV联合PCR不仅具有很好的特异性和敏感性,而且可以在短时间内(2 5h～3h)同时鉴定出上述三种病毒,因此具有良好的实验室诊断和临床应用价值。

摘要：本研究根据 Wesseling 发表的犬冠状病毒(CCV)K378株纤突蛋白(S)基因序列,设计合成了4条寡聚核苷酸引物 P1(18bp,1520—1537bp)、P2(19bp,2072—2090bp)和 P3(20bp,2621—2640bp)、P4(20bp,2944—2963bp)。以 P1、P2、和 P3、P4为引物,以美国 CCV NL—18株反转录产物为模板,建立了 CCV RT—PCR 方法,并将其中纯化的 P3和 P4PCR 产物标记 a—^(32)P同位素,制备了 CCV 特异核酸探针。以正常CRFK 细胞和 CCV NL—18株反转录产物为阴、阳对照,通过对犬瘟热、狂犬病、犬副流感、犬传染性肝炎和犬细小病毒5种对照病毒细胞培养物检测发现,分别以 P1、P2和P3、P4为引物,只有 CCV NL—18株 RT—PCR 产物在电泳凝胶上可见到大小为57bp和343bp 的核酸片断,与设计大小相同,正常细胞和对照病毒 RT—PCR 产物无核酸带出现;核酸探针检测结果,只有 CCV NL—18株呈阳性,正常细胞和对照病毒均为阴性。RT—PCR 和核酸探针对 CCV NL—18株反转录产物的检出敏感度分别为10^(-4)和10^(-3)/ul。以 P1、P2为引物对本室最近分离到的CCV—CS1、CCV—HH1、CCV—CI1和CCV—YI1四株病毒的第7代 CRFK 细胞培养物进行 RT—PCR 扩增,2%琼脂糖电泳,均获得571bp 的核酸片段。继而经 PVUⅡ酶切试验,CCV NL—18株和 CCV—CS1等四株病毒的 RT—PCR 产物均可切成418和153bp 两条核酸片段,与具有 PVU Ⅱ酶切位点的 CCV 强毒 K378株相同,而不同于无此酶切位点的 CCV 弱毒 Insavc—1株。用 CCV—CS1等四株病毒反转录产物与核酸探针杂交,结果均为阳性。上述结果证明,这四株病毒均为 CCV,而且在易变的 S 基因的1520—2090bp 之间无基因缺失和插入现象。通过本研究,不仅为 CCV 感染建立了敏感、特异的诊断方法;而且通过对国内首次分离获得的 CCV—CS1等四株 CCV 进行了初步研究,同时也为正在进行的 CCV S 基因的克隆、测序和表达研究奠定了基础。

摘要：根据GenBank中报道的CDV核苷酸序列,设计合成了2对特异性引物,对犬瘟热病毒小熊猫株(CDVLP)核蛋白(N)和融合蛋白(F)两种主要结构蛋白基因进行了克隆、测序及序列分析。结果表明,CDVLP株N蛋白基因全长1571bp,预测编码523个氨基酸;F蛋白基因全长1989bp,预测编码662个氨基酸,F蛋白氨基酸序列中含有5个潜在的N-联糖基化位点。聚类分析提示,CDVLP株是一株与CDV强毒株亲源关系很近的毒株。用DNAstar软件对CDVLP株和Onderstepoort弱毒株N蛋白和F蛋白进行了疏水性及抗原表位预测分析。抗原表位差异提示CDVLP毒株N和F蛋白的免疫原性可能要优于Onderstepoort弱毒株。在分子水平上阐明了CDVLP株的N和F蛋白基因更适合作为构建基因疫苗和重组活载体疫苗的目的基因。