摘要：【目的】克隆绿僵菌第五类Ser/Thr蛋白磷酸酶(PP5)基因,了解该基因及其编码产物的结构特征和两种产孢模式(微循环产孢和正常产孢)中的表达特征。【方法】通过绿僵菌中PP5基因EST序列与全基因组数据库比对,获得PP5基因DNA序列;通过同源蛋白比对预测PP5基因的DNA结构并设计引物,PCR扩增获取PP5全长cDNA序列;通过在线分析工具及生物软件进行蛋白结构分析。采用实时荧光定量PCR检测PP5基因在两种产孢模式中的表达特征。【结果】PP5基因长2100 bp,含7个外显子和6个内含子;cDNA开放阅读框长为1428 bp(GenBank登录号HQ317137),编码475个氨基酸;一级、二级及三级结构分析均显示较保守的蛋白磷酸酶结构特征。实时荧光定量PCR分析表明,PP5基因在绿僵菌微循环产孢的不同阶段表达水平具有显著性差异,特别是在孢子接种16、24、32 h高表达,而在正常产孢模式下表达量非常少。【结论】克隆了绿僵菌的PP5基因,详细了解了该基因及其编码产物的结构特征,发现了该基因在微循环产孢孢子形成后期高表达的重要特征,为进一步研究该基因在微循环产孢中的功能奠定了基础。

摘要：根据毕赤酵母密码子偏爱性,不改变毒素蛋白质一级结构,设计合成了昆虫神经毒素LqhIT2基因,并分别克隆至大肠杆菌融合表达载体pPET30-a(+)和毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K。在IPTG的诱导下,神经毒素在大肠杆菌中融合表达,表达产物经镍亲和层析纯化后,用于免疫BALB/c小鼠,制备了特异性较高的抗血清,抗体滴度超过1:128 000。利用制备的抗血清,采用斑点杂交,筛选得到了较高水平分泌表达重组LqhIT2的酵母转化子,摇摇摇摇下,毒素表达量约9 mg/L。大肠杆菌表达产物没有生物活性,酵母表达产物经注射蝗虫表现出杀虫活性。

摘要：微循环产孢是真菌遭遇逆境时发生的一种产孢机制,具有繁殖快速及抗逆性强等诸多优点。研究绿僵菌的微循环产孢机制并加以利用,对增强该菌在生物防治中的应用效果具有重要的意义。采用绿僵菌基因组数据库与NCBI数据库中同源蛋白比对获得Pyk基因DNA序列;分析Pyk基因结构并设计引物,通过RT-PCR扩增克隆Pyk全长cDNA序列。序列分析显示该基因cDNA全长1 934 bp,开放阅读框长为1 752 bp(GenBank登录号:HQ153828),编码产物为583个氨基酸的丙酮酸激酶,该酶与子囊菌门中其他真菌具有较高的相似性(57%-77%)。构建Pyk基因的RNAi载体,基因枪转化野生型绿僵菌获得3个突变菌株,RT-PCR证实3个干扰突变菌株中Pyk基因的干扰效率分别为:51%、56%、33%。对突变菌株的微循环产孢模式做了进一步分析,结果显示:与野生菌株相比,突变菌株产生更多的孢子形态类型,菌落周边的白色菌丝也相对较少。

摘要：根据毕赤酵母Pichia pastoris密码子偏爱性,不改变毒素蛋白质一级结构,设计合成了昆虫神经毒素BjαIT基因,并分别克隆至大肠杆菌Escherichia coli融合表达载体pPET30-a(+)和毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K。在IPTG的诱导下,神经毒素在大肠杆菌中融合表达,表达产物利用镍亲和层析柱纯化,纯化产物用于制备抗血清和活性测试。采用斑点杂交,筛选得到了较高水平分泌表达重组BjαIT的酵母转化子,摇瓶条件下,毒素表达量最大可达约20mg/L。大肠杆菌BjαIT表达产物对东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis和德国小蠊Blattela germanica没有活性,但酵母表达产物经注射东亚飞蝗和德国小蠊表现出杀虫活性。

摘要：根据中性海藻糖酶NTL基因的同源序列设计引物,PCR扩增出杀蝗专一菌株———金龟子绿僵菌CQMa102NTL基因片段,利用5′_RACE和3′_RACE扩增出NTLcDNA的5′和3′端序列,经拼接得到CQMa102NTL基因cDNA全长。根据其全长cDNA序列,设计引物PCR扩增出CQMa102NTL的完整基因。为了解该基因的上游调控信息,采用PanhandlePolymeraseChainReactionAmplification方法扩增其上游序列。序列分析表明,CQMa102NTL全长DNA3484bp,cDNA全长2385bp,编码737个氨基酸的蛋白,推测蛋白分子量为83.1kD;含有3个内含子,包含一个依赖于cAMP的磷酸化作用位点(RRGS)和一个钙附着位点(DTDGNMQITIED);上游序列含有一个压力反应元件(CCCCT);与金龟子绿僵菌广谱性菌株ME1NTL的核苷酸序列和氨基酸序列分别具有93%和99%同源性,由此确定该序列为金龟子绿僵菌中性海藻糖酶基因序列。Southern杂交表明,NTL基因在CQMa102基因组中为单拷贝。Northern杂交表明,NTL基因转录出约2.5kb的mRNA单带,在液体培养条件下,对数生长前期表达水平最高,对数生长后期降到最低,进入稳定生长期后表达水平又有所提高。金龟子绿僵菌CQMa102中性海藻糖酶基因DNA全长和cDNA全长登录GenBank,登录号分别为:AY557613,AY557612。

摘要：根据病毒外壳蛋白区序列设计PVX、PVS特异性引物对 ,根据P1基因区序列设计PVA特异性引物对 ,应用三重RT PCR同步检测马铃薯X病毒 ,马铃薯A病毒及马铃薯S病毒 ,分别得到 5 62bp、 2 5 5bp、 1 82bp大小的扩增片段。试验从反转录反应、PCR反应及循环条件 3方面讨论了试剂和循环条件对三重RT PCR同步检测 3种病毒的影响。结果表明反转录反应中dNTPs浓度、 3种病毒下游引物浓度比例对整个反应影响较大 ;其次是PCR反应中MgCl2 浓度和退火温度 ;反转录时间 ,循环条件对RT PCR影响较小。

摘要：根据酸性海藻糖酶的蛋白质序列设计引物,PCR扩增出CQMa102 ATM1的cDNA和DNA序列,登录号分别为:DQ237957,EF190950.序列分析表明,ATM1 DNA序列含有3个内含子,其开放阅读框(ORF)编码1个含1 073个氨基酸的蛋白质,具有1个20个氨基酸的信号肽序列和含有30个可能的N-糖基化位点(Asn-Xaa-Ser/Thr).NCBI序列比对(Blastn)显示该蛋白与Aspergillus fumigatus的alpha、alpha-trehalose glucohydrolase,Aspergillus nidulans的酸性海藻糖酶前体和Talaromyces emrsonii的酸性海藻糖酶分别有62%、59%和57%的氨基酸相似性,与另外两个真菌Saccharomyces cerevisiae(Ath1p)和Candida albi-cans(Atc1p)的酸性海藻糖酶也具有约25%的氨基酸相似性.Southern杂交表明,ATM1基因在CQMa102基因组中为单拷贝.

摘要：建立了松材线虫PCR检测标准化阳性对照及特异性强的PCR检测体系.根据松材线虫rDNA-ITS区和BxPe12基因的特异基因序列设计引物,并从中筛选出一对特异引物cqubs01/cquba01,该引物能从松材线虫特异性扩增出196bp片段,而不能对其他种类线虫进行扩增.基于优化PCR反应体系和反应程序,稳定的检测体系得以建立,检测灵敏度为100pg/μL.以松材线虫基因组DNA为模板,以上述特异引物进行PCR扩增,将纯化后的PCR产物与PMD18-T载体连接之后转入大肠杆菌中,筛选出阳性克隆进行测序验证,最终获得了松材线虫的无害化阳性对照,建立了松材线虫标准化阳性对照的PCR检测体系.对来自于不同地区的12批次近100个样品进行了实际检测验证,其结果与实际发生情况一致,说明本检测体系稳定可靠.

摘要：柑桔溃疡病是严重影响全世界柑桔生产的重大检疫性病害,根据柑桔溃疡病菌(Xanthomonas axonopodis ***)新近公布的全基因组中独有的保守蛋白基因序列,设计筛选出一对种特异性引物(JYF5/JYR5),能专一地扩增检出柑桔组织表面所带溃疡病菌的DNA靶带(413 bp)。而柑桔叶面附生的非致病性黄单胞菌、野油菜黄单胞菌近缘种以及健康柑桔样品都不能扩增;靶细菌DNA检测下限1.56 pg/μL,靶细菌悬浮液检测下限10 cfu/μL;在不同PCR仪及各种控温方式下都能稳定地扩增出特征性靶带。这一特异、准确的柑桔溃疡病菌PCR检验技术和研制的预包被固相化PCR检测试剂盒已开始用于我国非疫生产区建设中柑桔苗木、果实的病害检疫检验。

摘要：采用依据柑桔溃疡病菌独有蛋白基因的保守区段设计的特异性引物及其扩增体系进行测试。4种浸泡液中,浸泡液B的浸提效果最好,最佳浸泡时间为10～15min。浸提液进行加热灭活与不加热灭活处理,PCR扩增结果无明显差异。对于无症柑桔样品,浸泡液中加入终浓度为0.3%的Na2SO3可以降低植物色素、多元酚和铜制剂残留的Cu2+等抑制PCR反应物质的干扰作用。样品浸提液经过离心处理,不仅可以有效浓缩靶细菌,提高检测灵敏度,而且可以除去PCR反应抑制物质,大大降低了检测的假阴性。