摘要：目的:建立急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)患者C-KIT基因N822位点突变的drop-off微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)定量检测方法,并评价其临床应用价值。方法:针对C-KIT基因第17外显子设计一对引物及探针,优化drop-off ddPCR反应条件及体系,评价该方法的特异性、灵敏度、重复性,使用所建立的方法对140例已行Sanger测序的AML初诊患者骨髓标本进行检测,并用二代测序(next generation sequencing, NGS)验证结果;用drop-off ddPCR对3例阳性患者化疗后C-KIT突变频率进行动态监测。结果:drop-off ddPCR检测C-KIT基因N822位点突变的最适退火温度为54℃,空白检测限为1.62拷贝数/μL,最低检测下限为10.12拷贝数/μL,线性良好。140例AML初诊患者样本中Sanger测序检出2例阳性(1.4%),而ddPCR共检出突变7例(5.0%),突变频率为0.29%~7.41%;进一步应用常规NGS方法对ddPCR阳性样本进行验证,共检出阳性3例(2.1%),等位基因频率为1.26%~8.00%。动态监测3例阳性患者C-KIT突变频率,结果显示治疗达完全缓解时C-KIT突变频率明显下降甚至降低至0。结论:本研究建立了检测C-KIT基因N822位点突变的drop-off ddPCR技术,具有良好的方法学检测性能,其灵敏度高于Sanger测序和NGS,有望用于阳性患者缓解后的可检测残留疾病监测及治疗指导。

摘要：目的:建立检测急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)神经母细胞瘤RAS病毒癌基因同源物(NRAS)基因突变的drop-off微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)方法,并评价该方法的临床应用价值。方法:针对NRAS G12和G13突变位点设计特异性drop-off ddPCR引物和探针,建立最佳反应体系,并对该方法进行性能验证。应用该方法对140例临床样本进行初筛,其检测结果与Sanger测序进行比较,并用二代测序(next generation sequencing,NGS)进行验证。结果:建立drop-off ddPCR检测NRAS基因G12/G13突变的方法,灵敏度达0.158%,重复性、线性良好,其空白限为5.40拷贝数/μL,最低检测下限为15.84拷贝数/μL。在140例初诊AML患者中,drop-off ddPCR检出NRAS突变28例(20%),其突变负荷为0.26%~52.85%(中位2.14%);而Sanger测序仅检出7例(5%)阳性,为进一步验证,将21例Sanger测序结果阴性而drop-off ddPCR检测阳性的样本进行NRAS基因NGS,检出14例阳性,而另外7例NGS阴性的样本,其drop-off ddPCR检测突变频率为0.53%~1.50%(中位1.10%)。结论:建立了drop-off ddPCR技术检测AML患者中NRAS基因突变的方法,该方法灵敏度高,可用于对NRAS基因G12/G13突变进行定量检测,有望可用于AML患者预后判断和疾病监测。

摘要：目的:构建肿瘤标志物细胞角蛋白19(CK19)基因的原核表达载体,并在大肠埃希菌中进行表达,以获取低成本、高产量、高纯度的CK19蛋白。方法:根据基因库CK19的基因序列,设计多条用于基因拼接的DNA引物,利用PCR技术扩增CK19基因,用基因重组技术将该片段克隆到质粒p ET28a中,PCR和DNA测序鉴定。将重组质粒CK19-p ET28a转化大肠埃希菌BL21中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,使用镍柱亲和层析纯化蛋白,并用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹鉴定。结果:成功扩增出CK19基因片段,克隆到表达载体后经菌落PCR和DNA测序鉴定正确。重组质粒CK19-p ET28a在大肠埃希菌中经诱导和纯化后获得纯度较高目的条带,蛋白质印迹结果证明目的蛋白有反应性。结论:成功构建了肿瘤标志物CK19原核表达载体,经过诱导表达和蛋白纯化获得了高纯度有活性的目的蛋白。

摘要：目的建立甲基化特异性PCR(MSP)技术检测黏着斑激酶相关性鸟苷三磷酸酶调节因子(GRAF)基因启动子甲基化。方法设计针对GRAF基因启动子的MSP引物,建立MSP检测体系,对不同DNA模板进行检测,评价方法的特异性、重复性和灵敏度;对10例急性髓系白血病(AML)标本进行检测。结果建立的MSP方法仅能扩增出甲基化阳性模板,不能扩增出未甲基化阳性模板和未硫化处理的DNA模板;检测不同稀释度的甲基化阳性模板,其最大灵敏度可达2%;在不同时间进行MSP检测的结果均一致;对10例AML患者的初步检测发现7例存在着GRAF基因启动子甲基化。结论成功建立了检测GRAF基因启动子甲基化的MSP方法,有良好的特异性、灵敏度和重复性,可用于临床AML标本的批量检测。

摘要：目的建立高分辨熔解曲线分析(HRMA)技术检测急性髓细胞白血病(AML)中可溶性异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)基因突变。方法针对IDH2突变位点设计PCR扩增引物,建立带有温度内标校准品的PCR扩增体系,对98例AML患者标本进行PCR扩增,用HRMA技术对PCR产物进行突变分析,并通过DNA测序技术对HRMA结果进行验证。结果对98例AML样本的PCR产物进行HRMA检测,发现5例存在异常熔解曲线,对此5例标本及随机选择的HRMA显示为野生型的35例IDH2标本进行DNA测序验证,结果表明,存在异常熔解曲线的5例标本为4例R140Q突变和1例R172K突变,其余35例经DNA测序证实为野生型IDH2;对不同浓度梯度的R140Q质粒HRMA检测结果表明其灵敏度为2%。结论成功建立HRMA技术检测IDH2突变,其可用于AML标本的临床检测。

摘要：目的:对甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)引物设计进行探讨。方法:使用Methyl PrimerExpress Software Version 1.0软件、"methprimer"和"MSPprimer"的网上在线软件设计的引物以及参照国外文献的MSP引物对CCAAT/增强子结合蛋白ζ(CEBPζ),CCAAT/增强子结合蛋白δ(CEBPδ)、脆性组氨酸三联体(FHIT)和死亡相关蛋白激酶(DAPK)基因启动子进行MSP扩增,然后对其MSP产物进行测序验证以比较MSP引物设计的可靠性。结果:对于CEBPζ,CEBPδ,FHIT和DAPK启动子基因所设计的MSP引物经MSP后均获得了所需要的目的条带,但经测序鉴定Methyl Primer Express和methprimer设计的CEBPδ,CEBPζ-1的MSP扩增产物为假阳性产物,而MSPprimer设计的CEBPζ-2的MSP产物为正确序列。结论:MSP引物设计的质量是保证MSP扩增成功的关键因素。

摘要：目的：采用实时定量聚合酶链反应（RQ-PCR）法检测急性髓系白血病（AML）中黑色素瘤优先表达抗原（PRAME）基因转录本,初步评价其在AML中的临床意义。方法：设计PRAME基因引物,建立扩增PRAME基因转录本的EvaGreen染料法RQ-PCR法,对PRAME转录本克隆质粒进行扩增,评价其特异性、重复性和灵敏性。并对10例AML患者的骨髓单个核细胞标本进行初步检测。结果：所建立的EvaGreen RQ-PCR法具有良好的特异性,最低可检测到10个拷贝/μl的阳性模板,但其重复性差,而10^8～10^2拷贝/μl阳模的重复性良好。10例初诊AML患者PRAME转录本绝对含量为4.91×10^2～8.07×10^5拷贝/50ng（中位7.26×10^3拷贝/50ng）,ABL标化后的相对含量为4.42%～13 170.01%（中位67.98%）。而对照组8例缺铁性贫血患者中PRAME转录本相对含量为0.00%～0.01%（中位0）。1例AML患者诱导缓解后PRAME转录本下降,复发时又明显升高。结论：EvaGreen染料法RQ-PCR检测PRAME转录本方法敏感可靠,可用于AML患者临床监测。

摘要：目的:建立高分辨熔解曲线分析法(high-resolution melting analysis,HRMA),检测骨髓增生异常综合征(my-elodysplastic syndrome,MDS)患者中SF3B1基因的突变。方法:针对SF3B1基因热点突变位点(密码子E622、H662、K666和K700)设计PCR扩增引物,建立带有温度内标校准品的PCR扩增反应体系,对30例初诊MDS患者的骨髓标本进行PCR扩增,应用HRMA对相应PCR产物进行突变检测,并对HRMA检测结果进行DNA测序验证。结果:HR-MA检测发现2例MDS患者存在异常的熔解曲线,经DNA测序验证1例为K666M杂合子突变,另1例为K700E杂合子突变。所建立的HRMA技术检测SF3B1基因突变的灵敏度为0.05(5%)。结论:成功建立检测SF3B1基因突变的HRMA技术,可快速筛查MDS标本中的SF3B1基因突变。

摘要：目的:建立甲基化特异性PCR(MSP)技术检测死亡相关蛋白激酶(DAPK)基因启动子甲基化。方法:设计针对DAPK基因启动子的MSP引物,建立MSP检测体系对甲基化阳性模板进行检测,评价其特异性、重复性和灵敏性,并经测序鉴定。结果:所建立的甲基化MSP方法仅能扩增出甲基化阳性模板,不能扩增出未甲基化阳性模板和未硫化处理的DNA模板;对不同梯度稀释的甲基化阳性模板进行检测,其最大敏感性可达2%;在不同时间进行甲基化MSP检测的结果均一致。结论:成功建立的DAPK基因启动子甲基化MSP检测方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性,可用于肿瘤标本的批量检测。