摘要：目的构建BRAF基因序列特异性的短发卡RNA(shRNA)质粒载体,检测其对人黑素瘤细胞BRAF基因的干扰作用。方法设计2条BRAF基因序列特异性的shRNA编码序列和1条非特异性阴性对照序列,插入质粒pGenesil-1,双酶切和测序鉴定。用构建成功的3条质粒转染人黑素瘤细胞株A375和M14,分别采用RT-PCR和蛋白印迹检测其BRAF基因的mRNA和蛋白表达。结果所设计的shRNA序列被正确插入质粒pGenesil-1。非特异性对照质粒neg对黑素瘤细胞BRAF基因表达不产生干扰,2条序列特异性质粒braf 1和braf 2抑制了BRAF基因mRNA和蛋白的表达,其中braf 1干扰效果最为明显,最高抑制率可达90%。结论质粒介导的shRNA可成功干扰人黑素瘤细胞BRAF基因的表达,其抑制时间可持续至少1个月。

摘要：目的 探讨小鼠黑素瘤细胞B16F10与小鼠单核巨噬细胞RAW264.7共培养中Notch-RBP-J信号通路对巨噬细胞表型分化的影响.方法 设计针对CBF1/RBP-Jκ基因的siRNA编码序列,转染至小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞.实验分4组：沉默前共培养组,B16F10细胞与RAW264.7细胞共培养;沉默后共培养组,B16F10细胞与RBP-Jκ基因沉默后的RAW264.7细胞共培养;空白对照组,单独培养的RAW264.7细胞;阳性对照组,白细胞介素4刺激诱导的RAW264.7细胞.Western印迹法、ELISA法及流式细胞仪检测各组巨噬细胞的表型;RT-PCR法检测各组notch1、notch2、DLL1、DLL4及Hes1的表达.采用SPSS17.0软件进行重复测量方差分析及单因素方差分析、线性趋势检验、Bonferroni两两比较.结果 Western印迹结果显示,RAW264.7与B16F10共培养不同时间后,RAW264.7细胞的CD163在空白对照组、共培养24 h、48 h、72 h组、阳性对照组的相对表达量分别为1.016±0.018、1.274±0.034、2.065±0.094、3.615±0.144、3.099±0.071,经单因素方差分析（n=4）,F=527.42,P＜ 0.01,共培养后RAW264.7细胞CD163表达量较空白对照组增加;ELISA检测结果显示,共培养24、48、72 h,RAW264.7细胞培养上清液白细胞介素10的水平分别为（167.610±3.527）、（433.433±5.558）、（679.673±8.101） ng/L.沉默后共培养24、48、72 h,RAW264.7细胞培养上清液白细胞介素10表达量分别为（63.403±0.856）、（103.427±2.072）、（202.297±3.610） ng/L,较未沉默时降低（F=8.01,P＜ 0.05）.Western印迹法及流式细胞仪分别检测沉默后共培养RAW264.7细胞CD163、CD206的表达量,均较未沉默时减少（P＜0.05）.RT-PCR示,沉默后共培养组较沉默前共培养组及对照组的Notch信号通路相关基因mRNA表达均降低.结论 沉默Notch-RBP-J信号通路后共培养组中RAW264.7细胞向M2型极化较未沉默共培养组减少,总体表型仍为M2型;该通路的活化促进RAW264.7细胞向M2型极化.

摘要：目的 构建人泛素连接酶Cbl-b基因短发卡RNA（shRNA）重组慢病毒载体，探讨其对人黑素瘤A375细胞生物学行为的影响。方法 设计并合成3条沉默Cbl-b 基因的特异性shRNA及1条阴性对照shRNA，构建慢病毒载体。将A375细胞分成5组，即分别用3条特异性shRNA转染的CBLB-shRNA-1组、CBLB-shRNA-2组、CBLB-shRNA-3组，阴性对照组（阴性对照shRNA转染），空白对照组（转染空载体）。应用实时荧光定量PCR和Western印迹检测转染后72 h各组A375细胞沉默效率；CCK8法检测转染后24、48、72及96 h细胞增殖能力；流式细胞仪检测转染后72 h细胞凋亡情况、细胞周期，Transwell法检测转染后72 h细胞侵袭能力。结果 成功构建3条Cbl-b shRNA慢病毒载体，Western印迹示CBLB-shRNA-3蛋白沉默效率最高。CCK8检测表明，CBLB-shRNA-3组A375细胞增殖能力在转染后72 h和96 h较阴性对照组、空白对照组明显降低（均P 〈 0.01）。流式细胞仪检测示，CBLB-shRNA-3组凋亡率［（22.73 ± 6.58）%］明显高于阴性对照组［（6.08 ± 1.35）%］和空白对照组［（6.34 ± 1.07）%，均P 〈 0.01］。CBLB-shRNA-3组G1期细胞比例明显高于阴性对照组和空白对照组（P 〈 0.01），而S期细胞比例明显低于阴性对照组和空白对照组（P 〈 0.01）。Transwell检测示，阴性对照组、空白对照组和CBLB-shRNA-3组转染后72 h时穿膜细胞数分别为76.60 ± 1.82、73.20 ± 3.83、19.60 ± 1.14，差异有统计学意义（F = 794.50，P 〈 0.01）。结论 成功构建能高效沉默Cbl-b蛋白的CBLB-shRNA-3重组shRNA慢病毒载体，其可促进A375细胞凋亡，抑制A375细胞增殖、细胞周期进程和侵袭能力。