摘要：目的分别对来自兰氏分群A、B、C群链球菌的DnaK蛋白进行原核表达和纯化,并进行生物信息学分析。方法根据DnaK基因序列设计特异性引物,以A群链球菌化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)菌株CVCC593、B群链球菌无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)菌株S001和C群链球菌马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subspecies equi)菌株ATCC35246基因组为模板进行PCR扩增,用限制性内切酶BamH I和XhoⅠ双酶切pET-28a质粒和扩增得到的DnaK基因片段后连接,分别构建带His标签的重组质粒。经测序验证后,将重组质粒转化入大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导表达重组蛋白并纯化,采用SDS-PAGE电泳和Western blot进行分析验证。利用生物信息学工具对DnaK蛋白进行分析和预测。结果成功原核表达和纯化了3株不同兰氏分群链球菌的DnaK重组蛋白,分子质量约为70 ku。蛋白呈可溶性表达,经镍柱纯化后得到单一电泳条带的目的蛋白。Western blot检测该重组蛋白能被His标签抗体和R群链球菌猪链球菌(Streptococcus suis)DnaK蛋白的兔多克隆抗体识别。生物信息学分析A、B、C群的DnaK蛋白与R群DnaK蛋白之间同源性在90%以上;亚细胞定位分析显示DnaK蛋白主要存在于细胞质中;DnaK蛋白二级结构由α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲组成,以由α-螺旋占比较高,均在40%以上;蛋白互作网络分析表明,链球菌DnaK可能与DnaJ、GrpE、HrcA等蛋白发生互作。结论原核表达并纯化了A、B、C群链球菌的DnaK蛋白,生物信息学分析显示A、B、C群链球菌DnaK蛋白与R群DnaK蛋白的同源性高,且主要存在于细胞质中,为进一步研究链球菌DnaK蛋白的功能及其在致病机制中的作用奠定了基础。

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