摘要：【目的】鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii,AB)是引起医院内感染的重要条件致病菌之一,耐药性AB是目前防治的棘手问题。细菌外排泵是引起耐药性的重要原因之一,拟通过PCR检测鲍曼不动杆菌耐药结节分化家族(resistance-nodulation-division,RND)外排泵基因adeLFGH的分布,探索其与耐药性的关系;建立adeG耐药基因模型,利用CRISPR/Cas9系统对其进行靶向敲除的初步研究。【方法】运用肉汤微量稀释法检测耐药性分布;PCR筛查13株临床分离多重耐药鲍曼不动杆菌adeLFGH外排泵基因并分析其分布;扩增RND外排泵关键基因adeG并构建耐药细菌模型;设计特异性sgRNA,利用CRISPR/Cas9系统进行靶向敲除,药敏实验检测其敲除效果。【结果】13株临床鲍曼不动杆菌对多黏菌素E敏感,对左氧氟沙星耐药率较低,仅为38.5%,对头孢他啶的耐药率为92.3%,对妥布霉素耐药率为84.6%,对其他临床常见药物耐药率均为100%。13株多重耐药鲍曼不动杆菌adeLFGH携带率为100%。药敏实验结果显示adeG模型耐药菌株的哌拉西林、替卡西林/克拉维酸以及哌拉西林/他唑巴坦由敏感转为耐药,氯霉素、美罗培南、米诺环素由敏感转为中介。特异性sgRNA介导CRISPR/Cas9系统靶向敲除效率不同。pCas9-sgRNA1(adeG)靶向后哌拉西林/他唑巴坦的耐药性得到了逆转,对妥布霉素、四环素、多西环素、米诺环素的耐药性也有不同程度的降低;pCas9-sgRNA2(adeG)和pCas9-sgRNA3(adeG)使哌拉西林/他唑巴坦由耐药恢复到了中介,但对其他药物的耐药性逆转效果并不显著。【结论】特异性CRISPR/Cas9系统可以特异性敲除耐药基因,提示可为耐药菌的治疗提供新的思路和方法。

摘要：根据GenBank中发表的血管内皮细胞生长因子(VEGF)受体Ⅱ(KDR)基因序列,设计1对引物经RT-PCR从人脐静脉内皮细胞中克隆出KDR胞外Ⅲ区(KDRD3)编码序列,克隆入原核表达载体pGEX-6P1。重组质粒转化大肠杆菌BL21,用IPTG于37℃条件下诱导,经SDS-PAGE和Western blotting分析,表达出的融合蛋白大小为33.4 ku。利用纯化的重组融合蛋白免疫BALB/c小鼠,经淋巴细胞杂交瘤技术筛选获得2株KDR特异性单克隆抗体C4和F6。2株单抗均能特异性识别HUVEC细胞表达的天然KDR分子,HUVEC迁移抑制试验和HUVEC体外血管形成抑制试验结果显示,2株单抗均能特异性阻断血管内皮细胞生长因子与KDR分子的相互作用。结果表明:所获得的2株单抗对KDR具有良好的特异性和中和活性。