摘要：目的 试验旨在获得单核细胞增生李斯特菌新疆冷冻鸡肉分离株LM928中LIPI-4 Lm4b_02327基因的重组蛋白。方法 根据Gen Bank中LM Clip80459菌株(登录号CAS06084.1)Lm4b_02327序列设计特异性引物,利用PCR对Lm4b_02327基因进行扩增,纯化目的片段后克隆至pMD19-T载体,双酶切筛选阳性克隆进行测序。测序后利用软件预测Lm4b_02327序列编码蛋白质的理化性质、二级结构和三级结构,对该基因片段的核苷酸序列及编码的氨基酸序列进行同源性对比。同时构建pET32a-Lm4b_02327重组质粒,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,诱导表达,经SDS-PAGE检测、纯化蛋白后用Western Blot鉴定。结果 LM928菌株的Lm4b_02327基因全长为315 bp,共编码105个氨基酸,该蛋白为偏酸性、无信号肽、亲水性、无跨膜结构、定位于细胞质的不稳定蛋白,该蛋白质预测为PTSLacEⅡA组分。LM928菌株Lm4b_02327基因的核苷酸和氨基酸序列与CFSAN023463、52854、02-6680、02-6679、ICDC-LM188、LM3、N2306、GTA-L356和Clip80459菌株的同源性均为100.0%,与52860、FSL-J1-158和FSL J1-208菌株的核苷酸同源性分别为99.7%、97.8%和97.8%,与52860、FSL-J1-158和FSL J1-208菌株的氨基酸同源性分别为99.0%、94.3%和94.3%。系统进化树显示,LM928菌株的Lm4b_02327基因与4b血清型菌株聚为同一分支。经诱导后,pET32a-Lm4b_02327重组质粒在大肠杆菌BL21中大量表达,经SDS-PAGE和Western Blot鉴定表明该重组蛋白大小约为30 kDa,与预期大小一致。结论 本研究成功克隆Lm4b_02327基因,并获得该蛋白的大量表达,为深入研究蛋白功能奠定基础。

摘要：【目的】构建炭疽芽孢杆菌弱毒株C40-202 PA-LF 1融合基因表达载体并对其进行原核表达和反应原性检测,为炭疽亚单位疫苗制备、炭疽诊断和疫苗免疫效果检测提供依据。【方法】根据GenBank中登录的炭疽芽孢杆菌PA和LF基因序列设计2对引物,利用PCR方法从炭疽芽孢杆菌弱毒株C40-202中分别扩增出PA和LF 1基因片段,经XhoⅠ限制性内切酶消化后,通过黏性末端进行连接,获得PA-LF 1融合基因片段,利用SWISS-MODEL分析软件分别对PA、LF1和PA-LF1融合蛋白进行三级结构预测;将融合基因片段克隆至pET32a(+)质粒中,构建重组质粒pET32a-PA-LF1,并将重组质粒pET32a-PA-LF1转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,SDS-PAGE分析重组蛋白表达,Western blotting鉴定融合蛋白并分析其反应原性。【结果】从炭疽芽孢杆菌弱毒C40-202株成功扩增出PA、LF 1和PA-LF 1融合基因;成功构建了炭疽芽孢杆菌PA-LF 1融合基因表达质粒pET32a-PA-LF1,融合蛋白三级结构预测可折叠为正确的空间构象;构建的重组质粒经诱导表达、纯化和SDS-PAGE,获得分子质量为96 ku的融合蛋白,以包涵体形式表达;经Western blotting验证,纯化后的重组蛋白与经Ⅱ号炭疽芽孢苗免疫后的绵羊血清发生特异性结合,表明其具有良好的反应原性。【结论】PA-LF1融合蛋白具有良好的反应原性,可为炭疽诊断和疫苗免疫效果检测提供理论依据,同时也可作为一种炭疽亚单位疫苗的候选组分。