摘要：【目的】棕榈藤是重要的森林植物,纤鞭是其重要的攀援器官,也是重要的分类依据。研究黄藤NAC(NAM,ATAF和CUC)转录因子基因的分子特征并开发SSR分子标记,以期为棕榈藤的分子育种和辅助分类提供参考依据。【方法】以黄藤为材料,借助转录组数据,采用同源克隆的方法从黄藤中分离NAC基因,采用生物信息学方法进行基因结构、蛋白性质与结构分析和SSR位点预测,采用实时定量PCR技术分析基因的组织表达特性,利用PAGE电泳和测序技术分析SSR分子标记在不同棕榈藤样品中的通用性和多态性。【结果】从黄藤叶片中获得了2个NAC同源基因DjNAC3(Gen Bank登录号:KU556738)和DjNAC4(Gen Bank登录号:KX579750),二者的开放阅读框长度分别为729 bp和1 326 bp,对应的基因组序列为850 bp和1 441 bp,均包含2个外显子和1个内含子。DjNAC3和DjNAC4编码的蛋白分别为242 aa和441 aa。蛋白结构分析表明,DjNAC3和DjNAC4具有典型的NAC转录因子结构特征,属于NAC家族的CUC亚家族,但二者之间的相似系数仅为23.6%,表明它们在黄藤生长发育过程中可能具有不同的功能。DjNAC3和DjNAC4在不同组织中的表达模式存在明显差异,DjNAC3在发育成熟纤鞭中的表达丰度最高,叶片中的表达丰度最低,而DjNAC4则在发育成熟的钩刺中表达丰度最高,而发育初期的钩刺中最低。在DjNAC3和DjNAC4的基因组序列中分别包含1个SSR位点,其中前者的SSR位点位于内含子区域,为(TA)6,后者的SSR位点位于第1个外显子区域,为(GCA)5。根据DjNAC3和DjNAC4中SSR位点旁侧序列设计引物,以黄藤和另外20个不同棕榈藤样品的基因组DNA为模板进行扩增,PAGE电泳结果分析表明,引物具有较高的通用性,且扩增产物具有多态性。6个样品的测序结果证实,用DjNAC3设计引物的扩增产物测序获得的SSR位点序列存在着一定的差异,既包括SSR类型变异、重复次数变化等多态性,又有SSR位点缺失的现象;而根据DjNAC4设计引物扩增获得的SSR位点序列差异主要为重复次数的变化。【结论】黄藤DjNAC3和DjNAC4基因的基因结构、表达模式、SSR位点等均存在明显的差异,这表明它们在黄藤生长发育中可能具有不同的功能,二者所包含的SSR分子标记具有通用性和多态性,可以作为分子标记应用于棕榈藤的辅助分类和分子辅助育种。

摘要：【目的】miRNA作为一种非编码基因在植物生长发育以及抗逆等过程中起着重要的调控作用。通过分析毛竹miR397和miR1432前体序列的结构特点,研究其组织表达特异性,分析其经光照、温度、干旱、Na Cl等非生物胁迫以及激素处理后的表达变化,以期为进一步揭示其功能以及未来竹子抗逆育种的分子设计提供参考。【方法】通过茎环引物法和RT-PCR技术,以毛竹为材料分离miR397和miR1432的前体序列,利用在线平台Web LOGO分析miRNA成熟序列的碱基保守性,用MEGA 6.0软件构建基于miRNA前体的系统进化树。借助在线平台RNAfold Web Server预测二者前体二级结构。直接从Bamboo GDB下载phe-miR397和phe-miR1432前体上游的1 500 bp序列,利用在线平台Plant CARE分析其所含作用元件。采用实时定量PCR方法分析phemiR397和phe-miR1432在毛竹根、茎、叶和鞘中的表达情况,以及检测经黑暗、强光(1 500μmol·m-2s-1)、高温(42℃)、低温(4℃)、Na Cl(250 mmol·L-1)、GA3溶液(100μmol·L-1)、ABA溶液(100μmol·L-1)处理2 h后毛竹叶片中phe-miR397和phe-miR1432的表达变化。【结果】从毛竹中分别克隆出miR397和miR1432的前体序列,均为88 bp,且分别包含其成熟序列,均为21 bp。前体序列均能形成稳定的茎环结构,且成熟序列均产生于前体茎环结构5'端臂上。miR1432家族成熟序列的碱基保守性整体高于miR397家族。毛竹二者前体上游调控区均含有启动子基本作用元件,如TATA-box,CAAT-box;同时存在很多逆境(光、干旱、温度等)胁迫相关响应元件以及激素响应元件等,意味着phe-miR397和phe-miR1432可能受到逆境胁迫和激素的调节。phe-miR397和phe-miR1432均在叶鞘中表达丰度最高,最低丰度phe-miR397出现在幼茎中,而phe-miR1432则在叶片中。经强光、黑暗、高温、低温、Na Cl等胁迫处理后,叶片中phe-miR397和phe-miR1432的表达均下调;干旱和ABA处理后,phe-miR397的表达下调,而phe-miR1432则上调;GA3处理后,phe-miR397的表达上调,phe-miR1432则下调。【结论】phe-miR397和phe-miR1432作为毛竹中2个保守型miRNA,在受光照、温度、干旱和Na Cl的胁迫以及ABA和GA3的处理时,其表达均呈现了不同程度的下调或上调,这暗示着它们可能在毛竹应对非生物胁迫的抗逆过程中起重要的调控作用,且与内源激素的调节相关联。

摘要：Web MicroRNA Designer(WMD3)是一个专门应用于植物人工miRNA设计和前体序列设计的专业网站,其中利用重叠PCR法合成amiRNA前体序列,涉及多个PCR和纯化回收过程,步骤繁琐,周期较长。本研究利用WMD3设计了麻竹转录因子DlSCL6基因的人工miRNA序列和其前体序列,采用改进的重叠PCR方法,快速克隆获得了该前体序列,并以改造的pCMABIA1301载体为框架,构建了该前体的植物表达载体,为进一步研究利用amiRNA调控SCL6基因的表达奠定了基础。