摘要：目的构建正、反义hTERT基因真核表达载体,为进一步研究端粒酶的活性调节与恶性肿瘤基因治疗作准备。方法根据已发表在Genebank的hTERT cDNA序列,设计并合成了1对两端带特定限制性酶切位点引物,提取子宫颈癌HeLa细胞株总RNA,进行RT-PCR,并将扩增产物TA首先克隆至pGEMR-T载体,然后双酶切pGEM-T载体回收目的片段再克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(±)中,并对重组体进行酶切鉴定和测序分析。结果PCR扩增片段与预期结果相符,双酶切证实构建的正、反义hTERT基因真核表达载体克隆成功,插入片段测序结果与Genebank的hTERT cDNA的部分序列完全一致。结论成功地构建了正、反义hTERT基因真核表达载体,为下一步研究端粒酶的活性调节与恶性肿瘤基因治疗打下了实验基础。

摘要：目的　探讨反义hTERT基因体外对白血病细胞端粒酶基因表达及其活性的抑制作用。方法　采用基因重组技术设计并构建了针对端粒酶活性蛋白催化亚单位mRNA的 5′端序列的反义pcDNA hTERT真核表达载体 ,通过SuperFect(QIAGEN)将其瞬时转染人早幼粒白血病细胞株HL60 及人红白血病细胞株K562 ,并运用流式细胞术测定其细胞凋亡与细胞周期的变化 ,同时运用实时荧光定量逆转录 聚合酶链反应方法对其端粒酶蛋白催化亚单位基因的表达水平进行了检测 ,端粒酶活性的检测则采用了非放射性TRAP 银染法。结果　成功地构建了反义pcDNA hTERT真核表达载体 ,并将其转染至K562 和HL60 白血病细胞株。结果与空载体组、空白组相比 ,反义 pcDNA hTERT组体外显示出明显有效地抑制端粒酶的基因表达及其活性的作用 ;在细胞凋亡与细胞周期方面 ,反义组能引起细胞周期左移 ,增殖分裂能力降低 ,同时伴有细胞凋亡数的增加。结论　研究构建的反义hTERT基因体外确实能明显有效地下调白血病细胞端粒酶的基因表达及其活性 。