摘要：目的:制备大肠杆菌β-半乳糖苷酶(β-galactosidae)酶供体(ED)和酶受体(EA)片段,获得具有全酶活性的β-半乳糖苷酶。方法:以pSV-β-galactosidase control vector为模板设计引物,用PCR方法获得ED和EA片段DNA序列,插入克隆载体pGEM-T-easy中,获得重组质粒,经酶切、PCR及测序鉴定正确后,将酶切目的片段分别插入原核表达载体pET20b+,并转化大肠杆菌BL21,通过IPTG诱导表达出ED、EA融合蛋白,以亲和层析纯化蛋白,通过ED与EA蛋白形成β-半乳糖苷酶、全酶活性试验来判断ED、EA的功能。结果:获得与pSV-β-galactosidase control vector一致的ED、EA碱基序列,构建了重组表达质粒pET20b-ED及pET20b-EA,并分别转化入大肠杆菌DE3,以IPTG诱导行SDS-PAGE电泳,在相对分子质量为14000及116000处分别可见ED蛋白和EA蛋白条带,应用镍凝胶亲和层析纯化获得目的蛋白。结论:成功地制备了ED、EA蛋白,形成全酶活性的β-半乳糖苷酶。

摘要：目的构建针对胰岛素生长因子结合蛋白-2(IGFBP-2)的小干扰RNA(siRNA)表达载体,研究载体介导的RNAi技术对人U251脑胶质瘤细胞株中IGFBP-2表达的抑制作用。方法根据GenBank提供的IGFBP-2基因(NM-000597)核苷酸序列及siRNA的设计原则,设计合成4对带有BamHⅠ、HindⅢ酶切位点的发夹结构寡核苷酸序列,筛选得到576~594 nt、908~926 nt、938~956 nt 3个19 bp片段靶序列,同时随机组合出一条无关序列,应用限制性内切酶酶切和测序技术鉴定重组克隆。用脂质体介导转染人U251胶质瘤细胞株,采用RT-PCR和Western印迹方法检测细胞IGFBP-2 mRNA和蛋白表达。结果酶切筛选得到4个目的片段的阳性克隆,测序证实重组表达载体中插入序列与设计一致。RT-PCR和Western印迹检测显示构建的siRNA表达载体可显著降低U251细胞中IGFBP-2 mRNA和蛋白表达水平。结论成功构建载体介导的IGFBP-2靶向RNA干扰重组体,并能有效抑制U251细胞中IGFBP-2基因的表达。