摘要：克隆慢性髓系白血病 (CML)融合基因bcr abl融合位点周围的cDNA序列 ,构建重组真核表达载体并表达于 p815细胞 ,探索bcr abl基因免疫治疗CML的可行性。设计两条引物扩增bcr abl融合位点周围 46 8bp的cDNA ,测序正确后 ,将其克隆至真核表达载体pcDNA 3.1,通过电穿孔法转染至 p815细胞中 ,应用G418筛选阳性细胞克隆 ,在含 10 %FCS的RPMI16 40中常规培养 ,收集细胞进行RT PCR鉴定。结果PCR扩增出了可用于基因免疫的位于bcr abl融合基因位点周围的 46 8bp的cDNA ,序列测定除第 44 8位碱基C突变为T外其余序列均正确 ;构建了重组真核表达载体 ,并用电穿孔法将其转染 p815细胞 ,RT PCR法检测到该细胞系有bcr

摘要：目的探讨以血清、血浆为标本,免疫球蛋白重链(IgH)基因重排对B细胞淋巴瘤(BNHL)早期诊断的意义。方法收集病理活检确诊的BNHL患者的血清、血浆,提取肿瘤细胞释放的可溶性DNA。针对IgH基因第三互补决定簇(CDRⅢ)序列,设计引物扩增Fr3和JH区,PCR检测IgH基因重排的比率。结果以BNHL细胞系Raji细胞作为阳性对照,30例确诊的BNHL患者中25例阳性,阳性率83.3%。健康成人及慢性淋巴结炎患者呈阴性结果。IgH基因重排的检出率与患者临床表现、临床分期及肿瘤负荷不具有明显的相关性。结论以血清、血浆为标本,检测IgHCDRⅢ基因重排在临床具有较高的阳性率。标本取材方便,不受淋巴结肿大部位的限制,对BNHL患者的早期诊断具有一定的价值。

摘要：目的　探讨多单位核酶体外净化慢性粒细胞白血病 (慢粒 )骨髓的可能性 ,研究多单位核酶的体外切割活性及对慢粒细胞恶性表型的逆转作用。方法　针对慢粒发病中起重要作用的bcr abl融合基因 ,在融合位点两侧 4 4碱基范围内设计、合成 3个核酶 ,其中 2个切割位点位于bcr基因 ,1个位于abl基因。通过基因重组构建多单位核酶体外转录载体及逆转录病毒表达载体 ,鉴定其体外切割活性。将多单位核酶逆转录病毒表达载体转染K5 6 2细胞 ,应用MTT、3 H TdR掺入、RT PCR、斑点杂交、流式细胞仪、透射及扫描电镜等方法 ,检测多单位核酶对慢粒细胞增殖活性及细胞超微结构、细胞周期、凋亡等的影响。结果　多单位核酶的体外切割活性为 70 .8% ,逆转录病毒载体转染慢粒K5 6 2细胞系后 ,细胞DNA合成及细胞增殖受到明显抑制 ,转染后 96h抑制率达 5 0 %左右。多单位核酶转染细胞后能够有效切割细胞RNA ,使转染细胞RNA减少 10 0 0倍左右。流式细胞仪检测显示多单位核酶转染 72h后 ,18.4 %的细胞发生凋亡 ,大多数细胞被阻滞于G期 ,分裂期 (S期 )细胞数减少约 4 1.9%。透射、扫描电镜见转染细胞出现核固缩、凋亡小体等细胞凋亡的特异性表现。结论　多单位核酶不仅具有较高的体外切割活性 ,而且其逆转录病毒载体能够有效转染慢?

摘要：目的　构建单、双及三单位核酶 ,鉴定其体外切割活性及对K5 6 2生物学特性的影响 ,探讨核酶用于基因治疗的前景。方法　首先针对bcr abl融合位点设计并合成 3个单核酶 ,而后通过基因重组构建单、双及三核酶载体 ,以体外切割试验鉴定并比较其活性。然后以脂质体将bcr abl三核酶逆转录病毒载体转入K5 6 2细胞 ,观察其对K5 6 2细胞周期、凋亡、超微结构的影响。结果　构建成功bcr abl特异性系列核酶共 6个重组载体 ,切割试验证实系列核酶载体中三核酶体外切割活性最强 ,为 70 8% ,双核酶次之 ,分别为 6 0 7%和 30 3% ,不同位点的单核酶切割活性分别为 5 4 6 %、2 5 3%和3 6 %。bcr abl特异性多核酶通过诱导凋亡抑制K5 6 2细胞增殖。结论　bcr abl特异性核酶在慢性粒细胞白血病基因治疗中具有潜在的应用前景 ,为多核酶体外净化骨髓联合自体骨髓移植治疗提供了理论和实验依据。

摘要：目的克隆慢性髓系白血病(CML)融合基因bcr abl的cDNA序列 ,并在真核细胞中表达。方法以设计的两条引物扩增bcr abl融合位点两侧的cDNA ,测序后克隆至真核表达载体 pcDNA3.1 ,转染COS 7细胞。取常规培养的细胞进行RT PCR鉴定。结果①PCR扩增出490bp大小的cDNA ,其序列测定除第452位的碱基C突变为T外 ,其余序列均正确。②RT PCR法检测到转染细胞系中 ,有bcr ablmRNA的表达。结论成功地克隆了CML融合基因bcr abl融合位点两侧的490bp 序列并表达 ,为研制bcr abl基因疫苗治疗CML奠定了基础。

摘要：目的　研究 bcr- abl融合基因免疫在慢性髓系白血病(chronic myelogenous leukem ia CML )中的作用以及探讨CML 基因免疫治疗的可行性 .方法　设计两条引物扩增 bcr-abl融合位点两侧约 490 bp大小的 c DNA,经测序鉴定正确后 ,将其克隆至真核表达载体 pc DNA3.1,通过电穿孔法转染至 p815细胞 ,应用 G418筛选建立稳定的靶细胞 ,同时将重组真核表达载体肌肉免疫 BAL B/ c小鼠以获取特异的效应细胞 ,乳酸脱氢酶 (L DH)法检测特异性杀伤率 .结果　 1PCR扩增出可用于基因免疫的位于 bcr- abl融合基因位点两侧的490 bp大小的 c DNA,序列测定除第 45 2位碱基 C突变为 T外其余序列均正确 ;2构建了重组真核高效表达载体 ,命名为pc DNA/ bcr- abl;3G418梯度筛选建立了稳定表达该融合基因的细胞系 ,逆转录 -聚合酶链反应 (RT- PCR)检测到该细胞系有 bcr- abl m RNA水平的表达 ;4bcr- abl基因免疫后的小鼠能有效诱导出特异性细胞毒 T细胞 (cytotoxic T lymph-cyte,CTL) .结论　位于融合位点两侧的 bcr- abl基因肌肉免疫小鼠能够诱导特异性 CTL ,杀伤 bcr-

摘要：本文拟针对在慢性粒细胞白血病发病中起关键作用的ｂｃｒａｂｌ 融合基因， 构建特异性的系列核酶载体。为此，我们针对ｂｃｒａｂｌ 融合位点设计、合成了３ 个相邻的锤头状核酶。通过基因重组将３ 个单核酶按顺序定向克隆入改建的ｐＧＥＭ３ｚｆ 载体中，构建了ｂｃｒａｂｌ 单核酶、双核酶及三核酶体外转录载体， 并在此基础上将三单位核酶克隆入ｐ ＤｏＲｎｅｏ 载体中构建三核酶逆转录病毒载体。此外， 通过ＰＣＲ 方法， 扩增了ｂｃｒａｂｌ 融合位点附近约３７６ｂｐ 的序列，成功地构建了ｂｃｒａｂｌ 融合基因体外转录载体。本文构建的ｂｃｒａｂｌ 特异性系列载体，为今后遴选特异、高效的核酶打下了基础，并为将核酶用于自体骨髓移植的体外骨髓净化创造了条件。

摘要：目的：针对ｂｃｒ－ａｂｌ融合基因设计并构建３个针对不同位点的特异性单核酶体外转录载体，通过体外切割试验比较其对ｂｃｒ－ａｂｌ融合基因的切割效率，为慢粒基因治疗打下基础．方法：①首先针对ｂｃｒ－ａｂｌ融合位点设计、合成３个相邻的锤头状核酶，将其定向克隆入改建的ｐＤＥＳ载体中，构建３个单核酶体外转录载体并进行序列测定．②同时通过ＰＣＲ方法扩增ｂｃｒ－ａｂｌ融合位点３７６ｂｐ序列，克隆入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ载体中构建融合基因体外转录载体，作为核酶体外作用的模板．③分别将核酶及模板进行体外转录及同位素标记，通过切割试验比较不同核酶的体外切割活性．结果：本文通过体外切割试验证实３个单核酶对ｂｃｒ－ａｂｌ融合基因的切割效率分别为５４．６％，２５．３％及３．６％，核酶１效率最高．结论：针对ｂｃｒ－ａｂｌ融合基因不同位点的核酶具有不同的切割效率．本试验结果为遴选、研制高效的ｂｃｒ－ａｂｌ特异性单核酶及多核酶，进一步开展慢性粒细胞白血病核酶基因治疗创造了条件．