摘要：目的　针对柯萨奇病毒 3型 (CVB3)基因组重要功能区设计系列反义寡聚核苷酸序列 ,通过实验观察特异性反义核酸对病毒感染细胞的抑制作用。方法　通过病毒空斑形成试验及致细胞病变作用 ,了解反义核酸抑制及阻断CVB3 病毒感染细胞的能力。结果　实验所设计的反义核酸中SCB1对感染HeLa细胞的CVB3 病毒活性抑制作用较强 ,当病毒感染量为 1MOI时 ,病毒活性抑制率高达 90 % ;SCB4 和SCB2 均为 75 % ;SCB6有 5 0 %抑制作用 ;而SCB3 和SCB5以及非特异性对照序列对CVB3病毒基因基本没有任何作用。结论　通过以上实验确定SCB1、SCB2 、SCB4 等较好的抗病毒反义核酸序列 。

摘要：目的针对柯萨奇病毒A组24型(coxsackievirus A24,CVA24)基因组特殊功能区设计系列反义寡聚核苷酸序列,通过实验观察特异性反义核酸对病毒感染细胞的抑制作用。同时进行抗病毒作用的量效评价。方法通过抑制空斑形成实验、病毒致细胞病变作用及免疫印迹等实验,了解反义核酸抑制及阻断CVA24病毒感染细胞的能力,及经反义核酸抑制后病毒结构蛋白在感染细胞中的表达状况,并对抗病毒效果较好的反义核酸进行量效关系测定。结果从本实验所设计的8条反义核酸中,筛选出5条能较好抑制CVA24的反义核酸序列,分别为SCA547、SCA551、SCA554、SCA558、SCA568。当病毒感染量为1 MOI时,5μmol/L的上述反义核酸的病毒活性抑制率均在50%以上。经过量效关系分析显示,0.3μmol/L的SCA568已经对细胞产生较强的保护作用,对病毒空斑形成抑制程度达80%;在2.5μmol/L的SCA568保护下,病毒空斑抑制率达到90%以上,是几条反义核酸中抗病毒效果最好的一条。SCA568对病毒早期结构蛋白的表达有较强的抑制作用。而抗病毒效果稍差的SCA723,随浓度的增加也表现出一定程度对病毒蛋白表达的抑制作用。结论本实验所筛选的5条反义核酸SCA547、SCA551、SCA554、SCA558、SCA568能较好地抑制CVA24活性,为进一步研究反义核酸治疗和预防CVA24感染、防止CVA24引起的流行性出血性结膜炎的暴发流行打下基础。

摘要：目的探索一种适用于临床标本检测的肺炎支原体套式PCR．P1一RFLP基因分型方法并对其应用进行评价。方法参考肺炎支原体标准株P1基因RepMp4及RepMp2／3序列，分别在两个序列内部设计4条内套引物，采用文献报道的外套引物及新设计内套引物进行套式PCR扩增，扩增产物混合后用HaeⅢ酶切，根据不同的酶切图谱结果判断其型别，同时采用测序验证；对标准株DNA及临床标本DNA倍比稀释后进行检测，验证新改良方法敏感性；收集2012年肺炎支原体感染阳性标本，采用研究新改良的方法进行分型检测并与现有方法进行比较。结果经测序验证，以套式PCR为基础的P1-RFLP基因分型方法能够对临床标本进行很好的扩增；与现有的分型方法相比，新改良方法敏感性提高10^3倍，差异有统计学意义；北京地区2012年儿科肺炎支原体流行基因型为I型。结论套式PCR—P1-RFLP基因分型方法敏感性高，能够对临床标本进行很好的扩增。

摘要：实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,Real-time PCR）是根据荧光共振能量转移原理,设计相应的荧光标记核酸探针,通过PCR反应对靶DNA进行定性、定量测定的技术[1],可根据样品的循环阈值,参照标准曲线准确计算出样本内核酸的起始浓度,实现PCR从定性到定量的飞跃。

摘要：目的　得到肺炎支原体主要粘附蛋白 (P1蛋白 )的表达蛋白。材料与方法　用PCR产物限制性片段长度多肽性(RFLP)分析等方法鉴定实验用肺炎支原体菌株。针对P1蛋白基因设计上、下游引物 ,进行PCR扩增。对PCR产物进行回收、纯化 ,克隆入PET - 2 8C(+)表达载体 ,并转化入宿主菌BL2 1。对重组质粒进行酶切及PCR鉴定后 ,IPTG诱导目的蛋白在大肠杆菌BL2 1(DE3)中表达 ,并以Ni-Agarose亲和层析柱纯化。结果　 1)本实验所用菌株为肺炎支原体 2型。 2 )经PCR扩增得到预期含有BamHI和XhoI的 5 33bp的目的片段。 3)完成目的基因片段的克隆与表达 ,得到 2 0kDa左右表达蛋白。经诱导阳性质粒的蛋白表达 ,得到较大量纯化的目的蛋白。结论　本研究以国际标准株FH为模板 ,成功获得纯化的近 2 0kDa的P1蛋白片段 ,其大小与目的片段理论值相符 ,且此片段在肺炎支原体 1型与 2型中的基因同源性为 98%。为在基因和蛋白水平进一步研究肺炎支原体P1蛋白成分在肺炎支原体粘附和引起机体免疫反应中的作用机制 ,打下了良好的基础。

摘要：目的建立儿童呼吸道5种易感病原菌多重PCR(Multiplex PCR,mPCR)检测方法,并应用该方法分析北京地区儿童呼吸道易感病原菌菌群分布情况。方法分别设计针对肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,SP)自溶素基因(ply)、肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae,KP)16S核糖体RNA基因(16S rRNA)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)热核酸酶基因(nuc)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis,SE)特异性保守基因(SeS)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae,HI)16S rRNA基因的特异性引物,建立mPCR检测方法;验证该方法的特异性及敏感性;并采用该方法对北京地区128例呼吸道感染患儿和80名健康儿童咽拭子或痰标本进行检测,并与传统培养法检测结果进行比对。结果 mPCR法能对同一样品中5种病原菌的DNA模板同时进行PCR扩增;该方法检测5种病原菌之间及与呼吸道其他易感病原之间无交叉反应,敏感性可达5×10-10μg/μl;mPCR法检测128例呼吸道感染患儿的菌群分布情况为:HI 24.22%、SP 15.63%、KP 4.69%,SA 2.34%,未检出SE,与培养法相比,两种检测方法的总符合率为78.91%;感染患儿与健康儿童相比,HI和SP的感染率差异有统计学意义(P<0.01)。结论建立了从呼吸道标本中直接检测多病原儿童易感病原菌的mPCR检测方法,该方法特异性强、敏感性高,为临床正确诊断和治疗细菌感染性疾病提供了参考。

摘要：目的监测分析2011年夏季北京地区儿童腹泻主要病原菌,为该地区儿童腹泻病原的快速诊断与防治提供依据。方法收集2011年夏季在该院感染消化科就诊的腹泻患儿粪便标本,提取粪便标本DNA,设计特异性引物建立PCR方法对易导致儿童腹泻的最常见的3种病原菌进行检测,部分阳性结果测序验证,并与以往腹泻病原菌监测结果进行比较分析。结果在259例腹泻患儿中,总病原菌的检出率为69%,其中致腹泻型大肠杆菌属检出率为64%,志贺菌属检出率为15%,沙门菌属检出率为4.2%;男女儿童致病菌检出率、各年龄组间和急慢性腹泻天数比较差异均无统计学意义。本监测结果显示,致腹泻型大肠杆菌属是目前北京市引起儿童夏季腹泻的主要病原菌,其次为志贺菌属。结论 (1)2011年夏季北京地区引起儿童腹泻的主要肠道病原菌种类发生了明显的变化,以致腹泻性大肠杆菌属为主。(2)该研究建立的快速PCR法可检测多种儿童腹泻易感病原菌。