摘要：为了探讨CODEHOP RT-PCR技术在黄病毒属病毒筛查中的应用效果,根据GenBank发表的不同黄病毒多聚蛋白氨基酸序列,利用CODEHOP方法设计合成一对简并引物,用一步RT-PCR对乙型脑炎病毒株JEV1201、登革热病毒株JKD001和黄热疫苗YV6161进行检测,扩增产物测序后进行BLAST同源性比对和系统分生分析。结果显示该方法可以特异的对黄病毒进行扩增,目的片段的大小和序列与预期结果相符,JEV1201与乙脑病毒株YL2009-4/YC2009-3同源性最为接近,位于乙脑病毒株进化树分支。JKD001与登革热病毒株DENV-2/ID/1022DN/1975同源性最为接近,位于登革热病毒株进化树分支。YV6161与黄热病病毒株17D同源性最为接近,位于黄热病病毒株进化树分支。由此可知CODEHOP RT-PCR技术可以被有效的用于对黄病毒属病毒的筛查、种类鉴定和分子溯源。

摘要：目的库京病毒(Kunjin virus,KUNV)为黄病毒属病毒,是西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)的亚型。由于我国存在其流行的生态学条件,传入的风险很大。因此,亟待建立快速、灵敏、高效的TaqMan荧光RT-PCR方法用于国境口岸KUNV的监测,防止其传入。方法从GenBank中检索KUNV全基因序列,通过MEGA 4软件进行序列比对和Blast进行保守序列搜索分析,选取E基因片段为模板。利用Beacon Designer 7.0软件针对模板设计引物和探针,进行TaqMan荧光RT-PCR检测并优化反应条件和引物浓度,退火温度设定为50、55、60℃,引物终浓度设定为200、400、800nmol/L,探针终浓度设定为100、200、400nmol/L,通过扩增曲线与Ct值分析确定最佳退火温度、最佳引物及探针终浓度并验证该方法的敏感性和特异性。结果通过分析比较,确定KUNV荧光RT-PCR检测方法最佳退火温度为55℃,引物终浓度为400nmol/L,探针终浓度为200nmol/L。该方法检测KUNV核酸的敏感度达1.83×102copies/μl,且与正布尼亚病毒属拉克罗斯病毒(La Crosse virus,LACV)、雪靴野兔病毒(Snowshoe hare virus,SSHV),甲病毒属巴马哈森林病毒(Barmah Forest virus,BFV)、马雅罗病毒(Mayaro virus,MAYV),黄病毒属乙脑病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)、黄热病毒(Yellow fever virus,YFV),东南亚十二节段RNA病毒属版纳病毒(Banna virus,BAV)均无交叉反应。结论建立的TaqMan荧光RT-PCR方法灵敏度高、特异性好,适合于KUNV的快速检测,具有应用价值。

摘要：目的建立一种能快速检测黄病毒属病毒的CODEHOPRT—PCR方法。方法根据GenBank发丧的不同黄病毒多聚蛋白氯基酸序列，利用CODEHOP方法设计合成一对引物，建立能快速检测黄病毒属所有病毒的CODE～HOPRT—PCR方法，并用3种不同病毒株对该方法进行特异性和灵敏度评价。结果建立的CODEHOPRTPCR能埘黄病毒RNA进行特导性扩增，目的片段的大小（400-500bp）和序列与预期结果相符。该方法对黄病毒恢酸的最小检出量为8Pg。结论建立的CODEHOPRT—PCR方法特异强、灵敏高，可用于黄病毒的榆测。

摘要：目的建立5种生物恐怖细菌的快速、高通量的基因悬浮芯片检测方法,即炭疽芽胞杆菌、鼠疫耶尔森菌、布鲁菌、土拉弗朗西斯菌和类鼻疽伯克霍尔德菌的多重检测。方法针对炭疽芽孢杆菌、鼠疫耶尔森菌、布鲁菌、土拉弗朗西菌、类鼻疽伯克霍尔德菌的特异性基因序列设计6对引物和相应的特异性探针,经多重PCR扩增并用生物素标记相应的基因片段,标记的PCR产物与包被在不同编码微球上的相应探针杂交,用悬浮芯片扫描仪检测。结果多重PCR悬浮芯片检测体系能够正确的检测和鉴定5种生物恐怖细菌,特异性好,灵敏度高,可用于恐怖样本的高通量筛查。结论建立了多重PCR基因悬浮芯片快速检测几种生物恐怖细菌的方法。

摘要：目的建立快速、高通量的基因悬浮芯片检测方法，用于生物恐怖病原体的快速筛检。方法选择保守的细菌16S rDNA序列，并针对炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis，B．a）、鼠疫耶尔森菌（Yersinia pestis，Y.p）、布鲁菌属（Brucella spp.，Bru）、土拉弗朗西斯菌（Francisella tularensis，F.t）和类鼻疽伯克霍尔德菌（Burkholderia pseudomallei，B．P）等5种生物恐怖细菌设计种（属）特异性探针，经16S rDNA通用引物341A、519B扩增基因组DNA，用基因悬浮芯片方法进行检测，并对方法的灵敏度、特异度、重复性、检测能力进行验证。结果经16S rDNA通用引物扩增，特异性探针杂交检测，能将样本细菌鉴定到属水平，同属菌出现交叉反应；检出限分别为类鼻疽伯克霍尔德菌1．5pg／μl，布鲁菌属20pg／μl，炭疽芽孢杆菌7pg／μl，土拉弗朗西斯菌0．1pg／μl，鼠疫耶尔森菌1．1pg／μl；15次重复检测各探针变异系数（CV）为5．18％～17．88％，具有较好的重复性；方法可正确检出模拟白色粉末样本中炭疽芽孢杆菌和鼠疫耶尔森菌。结论建立了通用型基因悬浮芯片检测体系快速高通量筛查生物恐怖细菌的方法。

摘要：通过对 33所高等医学院校医学免疫学实验教学的情况调查 ,结果是实验开设项目平均为 1 3.55项 ,其中学生独立操作项目为 7.97项 ,学生人均经费仅 2 2 .0 3元 ;所开项目以传统的实验项目为主 ,新项目不多 ,更缺少综合性和设计性项目。

摘要：[目的]建立昆津病毒和巴马哈森林病毒双重RT-PCR检测方法。[方法]利用Beacon Designer7.0软件设计引物,以人工合成昆津病毒巴马哈森林病毒E基因的片段作为模板,验证该方法的灵敏度及特异性。[结果]最低检出限:昆津病毒1.83×106 copies/μL,巴马哈森林病毒2.02×106copies/μL。[结论]建立的昆津病毒和巴马哈森林病毒双重RT-PCR检测方法具有灵敏度高、特异性好等特点,适合于昆津病毒和巴马哈森林病毒的快速检测。

摘要：目的建立Banna病毒核酸特异的快速、敏感的TaqMan探针RT-PCR检测方法。方法首先对从GenBank中检索到的所有Banna病毒的序列进行同源性分析及引物、探针的设计。病毒在BHK21细胞或C6/36细胞上繁殖扩增后提取病毒RNA和逆转录。以cDNA为模板分别进行TaqMan探针法RT-PCR和传统的PCR检测,并对方法的种内广谱性和特异性、检测灵敏性以及用于蚊虫和临床标本的适用性等进行评价。结果Banna病毒核酸特异的TaqMan探针RT-PCR检测方法具有较好的种内广谱性和特异性,可以检出所有12株Banna病毒,而其他虫媒病毒如辛德毕斯病毒、乙型脑炎病毒、batai病毒和环状病毒检测结果均为阴性。与传统PCR相比,敏感性高100倍以上,可以检出每50μl标本中含有0·5CCID50的Banna病毒。单链RNA变性条件(65℃)进行逆转录使检测结果的敏感性比99℃变性法最少低10倍。病毒在室温保存1天和4℃保存1周后,检出敏感性会比原来低10倍左右。该方法在检测模拟感染Banna病毒的人血清标本以及蚊虫标本时,均显示出较好的特异性。112份蚊标本中检出6份标本阳性,4份可疑阳性,病毒分离结果3份阳性。结论本实验成功建立了Banna病毒特异性核酸的TaqMan探针RT-PCR检测方法,并初步证实可用于血清标本和媒介蚊虫标本的检测,为开展Banna病毒的流行监测及临床早期诊断提供了新的技术手段。

摘要：目的建立用于检测黄病毒属的TaqMan探针荧光定量RT-PCR方法。方法从GenBank中检索黄病毒属代表株的全基因序列,通过DNAstar进行序列比对和blast进行保守序列搜索和分析,用Beacon Designer 7.0软件进行引物和TaqMan探针设计,以乙脑毒株MB090509 RNA为模板,优化反应条件并应用于现场蚊虫标本检测。结果确定黄病毒属TaqMan探针荧光定量RT-PCR反应条件为:45℃15 min,95℃10 min,95℃10 s→54℃45 s,40次循环,引物和探针终浓度为200 nmol/L。灵敏度为常规RT-PCR方法 100倍,检出限2.9×10-3噬斑形成单位(PFU)/mL,与甲病毒属、东南亚十二节段RNA病毒属、布尼亚病毒属均无交叉反应。从161份现场蚊虫标本中检测出11份阳性标本,经病毒分离、测序均被证实为乙脑病毒。结论本研究建立的黄病毒属TaqMan探针荧光定量RT-PCR方法具有广泛应用价值。

摘要：目的建立一种检测伯氏疏螺旋体的分型多重实时荧光定量PCR方法,可对3种致病基因型伽氏疏螺旋体***、阿氏疏螺旋体***、狭义伯氏疏螺旋体*** sensu stricto检出并分型。方法针对3种基因型菌株的外膜蛋白osp C基因,在保守序列设计通用引物并分别设计型特异Taqman探针,3条探针分别标记FAM、Texas Red和CY5荧光报告基团,建立和优化多重实时荧光定量PCR反应体系,检测其敏感性和特异性。结果建立的多重荧光定量PCR的最低检测值为*** 40copies/μl、*** 5.17copies/μl和*** sensu stricto 37.8copies/μl,通过检测立克次体、土拉弗朗西斯菌无交叉反应,检测100只游离蜱与常规PCR结合测序结果分型一致,说明本方法有较好的灵敏性和特异性。结论该方法能快速检测伯氏疏螺旋体并同时分型,为莱姆病的诊断提供新方法。