摘要：根据已知的大豆1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylatesynt-hase,ACC合酶)基因序列(GenBank Accession No:dq273840)设计三个基因特异的反向引物CTA798sp1,CTA798 sp2,CTA798 sp3,分别与4个简并引物配对,通过热不对称PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR)扩增,获得了该基因上游约600bp的序列。利用5'-cDNA末端快速扩增(5'Rapid Amplification of cDNA ENDs,5'-RACE)实验,确定转录起始位点(TTS)位于起始密码子上游164 bp处,由此获得了大豆ACC合酶基因上游长约328bp的启动子序列。用PLACE和PLANTCARE软件分析此序列,发现该序列具有启动子的基本元件TATA-box和CAAT-box;此外发现三个胁迫诱导元件:光应答元件Box1,Box4和诱导物应答元件W-box。以pBI121为基础,进一步构建了由ACC合酶基因上游调控序列启动的GUS基因植物表达载体,通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草叶片,瞬时表达结果表明GUS基因在该片段的调控下获得了表达,该片段具有启动子活性。

摘要：设计合成了一种含有碱性磷酸酶抑制剂——对氨基苯磷酸的新型偶氮染料配基并将其偶联到凝胶Sepharose CL-6B 上,制备出新型的亲和层析介质,分离纯化小牛肠中的碱性磷酸酶。通过考察不同配基密度的层析介质对碱性磷酸酶的选择性,得出配基密度为4.55mg 配基(g 湿胶)-1的层析介质选择性高。用NaCl和Na2HPO4进行阶段洗脱,可使酶的纯化倍数一步达到65倍,活力回收率达到89%。通过测定不同配基浓度下酶的动力学,发现新合成的配基是碱性磷酸酶的竞争性抑制剂,其KI为3.0×10-3mol L-1。

摘要：根据GenBank中已登录的FormⅡRubisco (cbbM)基因序列 ,设计一对引物R1和R2 ,并在引物 5′端分别加上SmaⅠ和NotⅠ位点。以血色红假单胞菌 1 2 3 5 2的染色体为模板 ,通过PCR扩增目的片段 ,克隆后测序。核苷酸序列测定结果表明 ,该菌株的cbbM基因全长为1 ,3 86bp ,共编码 461个氨基酸 ,推导的氨基酸序列与其它生物相应序列的同源性在 76%～90 %之间。

摘要：采用RLM-RACE法,根据已获得的盐角草胆碱单加氧酶基因的部分序列,设计2条特异性嵌套PCR引物,成功地克隆了该基因cDNA 5′末端全序列,测序结果显示该片段包括5′UTR 154个核苷酸和编码区606个核苷酸,编码N端202个氨基酸.Blast P结果表明,该片段编码的蛋白序列与辽宁碱篷及其他藜科植物的胆碱单加氧酶同源性达到85%以上.同时找出了其转录起始位点,即为该序列的第1个碱基g.

摘要：磷酸胆碱是合成磷脂酰胆碱和甘氨酸甜菜碱的重要前体,磷酸乙醇胺N-甲基转移酶(PEAMT)是磷酸胆碱合成的关键酶。根据已知的SePEAMT cDNA5′端序列设计2个基因特异的反向引物(PP1,PP2),通过锚定PCR获得了PEAMT起始密码子上游1249bp的序列。RLM-RACE反应确定其转录起始位点A位于起始密码子上游301bp处,由此获得了948bp的SePEAMT启动子序列。PlantCARE和PLACE在线启动子预测工具分析表明:该序列除了含有启动子的基本元件TATA-box和CAAT-box外,还含有一些胁迫诱导元件(如ABRE、HSE、LTR)和花粉特异的激活元件AGAAA。构建了SePEAMT启动子与报告基因GUS融合的表达载体pPro,并通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草,染色结果表明SePEAMT启动子可以有效地驱动GUS基因的瞬时表达。

摘要：疾病的基因治疗需要安全、高效、靶向性的分子载体。通过对pRNA分子的结构和作用机理的研究,发现pRNA分子极易穿过细胞膜,有多个结合位点,能有效转导多个外源分子进入靶细胞,在体内几乎不引起免疫反应,而且可能通过设计多功能靶向复合物将疾病的检测和治疗有机地结合在一起,成为一种理想的基因治疗型载体。

摘要：根据同源性分析设计引物 ,通过RT PCR方法从大连蛇岛蝮蛇毒腺总RNA中合成扩增出类凝血酶基因 ,之后将该基因克隆到表达载体 pPIC9K中 ,经电激转化后整合至毕赤酵母细胞基因组中 .经筛选得到甲醇快速生长型转化子His+ Mut+ 在 5 0 0ml摇瓶中培养 ,甲醇诱导分泌表达 .上清液中重组类凝血酶是通过两步柱层析得到 :QSepharoseFF和Benzamidine Sepharose 4BCL .与天然蛇毒类凝血酶一致 ,分泌表达的重组类凝血酶具有较强的酯酶活性 ,但精氨酸甲酯如TAME的水解活性较弱 .此重组类凝血酶在 37℃中性溶液中保存过夜将分解成小肽 ,但在 0℃下很稳定 .该酶的最适pH为 8 0 .

摘要：通过转化缓冲溶液调整转化系统的渗透压,实现了含有smGFP基因的最小线性化元件在洋葱表皮细胞中的直接转化和瞬时表达。利用荧光显微镜在细胞质和细胞核中观察到很强的绿色荧光蛋白的表达,表明smGFP线性化元件顺利导入细胞内,并维持了表达元件的完整性。该方法仅通过缓冲溶液的设计实现外源基因的直接转化,无需基因枪、电激、注射等转化动力来源,能够显著减少实验操作对受体材料的破坏性,扩大转化受体的应用范围,同时操作简便快捷,大大降低了实验成本。

摘要：根据已获得的辽宁碱蓬 (SuaedaliaotungensisKitag)胆碱单加氧酶cDNA的部分序列 ,设计一条基因特异性引物 ,与通用引物并用 ,一步PCR成功地克隆了辽宁碱蓬胆碱单加氧酶cDNA 3′末端。与常规的3′_RACE法相比 ,一步PCR法具有快速、简便、经济等优点 ,是一种非常快捷的扩增cDNA

摘要：将编码大连蛇岛蝮蛇类凝血酶 (Gloshedobin)的基因克隆于表达载体pET 32a( + )中 ,以融合蛋白形式在大肠杆菌中获得表达。在 2 5℃下经 1mmol LIPTG诱导 6h ,SDS PAGE和蛋白质印迹分析表明 ,部分融合蛋白以可溶形式存在于大肠杆菌的细胞质中。针对金属螯合亲和层析分离某些含His 标签重组蛋白质时专一性不高 ,并且存在配基泄漏的缺陷 ,设计合成了以抗重组类凝血酶的鸡卵黄免疫球蛋白为配基的免疫亲和层析柱。通过疏水色谱OctylSepharoseFF ,IgY免疫亲和层析以及强阴离子交换色谱SourceQ等三步柱色谱分离纯化获得比活力为 45 4 7U mg的重组蛇毒类凝血酶 ,活力回收率为 34 8%。蛋白质印迹分析和纤维蛋白原凝结活性分析表明 。