摘要：通过同源性比较设计引物,分别扩增羊驼KIT基因exon18~19和intron18,并利用PCR-SSCP技术对我国现有羊驼KIT基因intron18进行多态性分析。结果表明:羊驼KIT基因exon18~19长225 bp,包括54 bp的exon18(全长112 bp)1、08 bp的intron18和63 bp的exon19。从测序结果看,intron18与exon18和exon19交际处有GT-AG规则,符合分子遗传学理论。而用另1对引物扩增不同毛色羊驼Intron18所得的核苷酸序列与exon18~ex-on19中测得的intron18序列完全相同,未发现"AGTT/TGGA/TTAG"缺失突变现象和核苷酸片段大小差异,即不存在多态性。因此推测在同一品种内,KIT基因对毛色影响的原因不一定是由于KIT基因intron18缺失4个碱基导致KIT基因表达失调而致。

摘要：本文主要介绍了氨洗工艺长周期稳定运行的关键控制因素。该技术的控制难点在于酸碱中和反应产物p H值和溶液浓度的控制,控制的精准度直接影响设备的腐蚀情况,为氨洗工艺设计和操控提供参考性建议,也是决定该工艺能否大范围推广使用的关键所在。

摘要：为揭示转导蛋白(β)样1X连接受体1(TBL1XR1)对水疱性口炎病毒(VSV)复制的影响,首先设计并构建沉默TBL1XR1的shRNA表达载体,并以其作为包装慢病毒的穿梭质粒,同骨架质粒共转染239T细胞后,成功包装出表达shTBL1XR1的慢病毒颗粒。以慢病毒感染小鼠巨噬细胞RAW264.7并建立TBL1XR1表达沉默的细胞系,同时构建不靶向任何基因的对照细胞系。最后,用VSV感染TBL1XR1沉默细胞系,并通过荧光定量PCR方法检测VSV的复制能力。结果发现,对TBL1XR1进行沉默能显著抑制VSV的复制,推测TBL1XR1及其相关复合物在VSV侵染过程中起到了一定的辅助作用。研究结果不仅为揭示VSV的致病机理奠定基础,也对VSV的疫病防控起到一定的指导作用。

摘要：干扰素诱导蛋白44(IFI44)作为Ⅰ型干扰素(IFN)家族成员之一,在IFN依赖的抗病毒应答过程中发挥重要作用。前期研究表明,水疱性口炎病毒(VSV)感染可诱导宿主细胞IFI44显著上调。为进一步明确IFI44因子在VSV感染过程中的作用,本研究分别设计、构建IFI44基因沉默和过表达载体,将其作为穿梭质粒与慢病毒骨架质粒共转染293T细胞,成功包装出表达shIFI44及IFI44基因的慢病毒颗粒。在此基础上,将表达shIFI44及IFI44基因的慢病毒分别感染RAW264.7小鼠巨噬细胞,经嘌呤霉素筛选后建立相应细胞系。以VSV分别感染上述2种细胞系,通过荧光定量PCR法及TCID50法检测病毒的复制水平。上述研究结果表明,IFI44对VSV在宿主细胞中的复制增殖具有明显的促进作用。该研究结果不仅有助于揭示VSV致病的分子机制,而且为水疱性口炎(VS)疫病的防控提供新的思路。

摘要：针对羊传染性脓疱病毒(ORFV)B2L基因序列设计合成了1对引物,以含有该引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测ORFV核酸的SYBRGreenⅠreal-timePCR方法。结果显示,该方法线性关系良好,标准曲线的相关系数为0.999;检测灵敏度可达9.4×104copies/μL;与绵羊痘病毒(SPV)不发生交叉反应,具有良好的特异性;组内Ct值相同,组间变异系数小于2%。应用建立的方法检测20份疑似羊传染性脓疱病病料,结果17份为阳性,同时用常规PCR进行检测,结果仅10份为阳性。结果表明,建立的实时荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可初步用于ORFV的检测。

摘要：参照GenBank中水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)G蛋白基因的核苷酸序列,设计合成1对特异性引物,采用RT-PCR方法扩增约为810bp的G基因片段,并将其克隆到pGEX-4T-1表达载体上,将经PCR、酶切鉴定以及测序分析正确的阳性重组质粒命名为PGEX-G810,之后将其转化至表达菌株*** BL21(DE3),经IPTG进行诱导表达;表达产物经SDS-PAGE、Western blotting等方法进行检测。SDS-PAGE结果表明,重组蛋白主要以包涵体形式存在,相对分子质量约为60 000;包涵体经变性、复性、Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化后,分离得到复性的融合蛋白。纯化的融合蛋白能与VSV阳性血清发生特异性免疫反应,证明表达的目的蛋白具有良好的抗原性。

摘要：核受体共抑制因子1(NCOR1)组织分布广泛,可调节基因转录。前期研究表明,与NCOR1功能密切相关的转导蛋白(β)样1X连接受体1(TBL1XR1)在水疱性口炎病毒(VSV)复制进程中发挥促进功能。为明确NCOR1因子在VSV复制增殖过程中的作用及机制,首先设计并构建靶向Ncor1的shRNA过表达质粒shNcor1。将shNcor1质粒与骨架质粒共转染293T细胞,获得表达shNcor1的慢病毒颗粒。用慢病毒感染小鼠巨噬细胞(RAW264.7)并构建Ncor1基因沉默细胞系。VSV分别感染Ncor1沉默与对照细胞系后,通过Q-PCR和TCID检测VSV的转录、复制水平。结果表明,Ncor1基因沉默能抑制VSV的转录及复制。此外,当Ncor1基因沉默时,经VSV诱导的干扰素相关基因Ifit1及Ifit2的转录水平显著升高,提示NCOR1对病毒复制的调控与干扰素信号的激活相关。本研究从宿主细胞出发为阐明VSV的致病机制提供了新的思路。

摘要：利用MDBK细胞从长春郊区一养羊户送检的出现典型"口疮"症状的病羊唇部痂皮中分离获得1株病毒,通过电镜观察、理化学测定、PCR检测、动物回归试验、间接免疫荧光(IFA)及病理组织学观察等方法对该株病毒进行了系统鉴定,证实该分离株为羊传染性脓疱病毒(Orfvirus,ORFV),命名为ORFV-cc。参照GenBank中ORFVF1L基因的核苷酸序列,设计合成1对特异性引物,成功地对ORFV-cc株F1L基因进行克隆、测序,并推导出其氨基酸序列。序列分析表明,获得的ORFV-cc分离株F1L基因片段长987bp,编码328个氨基酸,与ORFV-NZ2,ORFV-7,ORFV-20,ORFV-C2,ORFV-mi-90,ORFV-Torino株核苷酸序列同源性分别为97.5%,98.3%,97.9%,98.5%,98.4%,97.5%;氨基酸序列同源性分别为97.2%,97.2%,97.5%,98.8%,98.8%,97.9%。系统发育进化树结果表明,ORFV-cc分离株与参考毒株ORFV-C2和ORFV-mi-90的亲缘关系较近,表明不同地区分离毒株的F1L基因差异不大。

摘要：为探讨传染性脓疱病毒感染后机体的细胞免疫应答,从分子水平对传染性脓疱病毒的免疫机制进行了深入探讨。首先针对Th1型细胞因子IFN-γ、IL-2以及管家基因GAPDH的mRNA序列分别设计了1对特异性引物,扩增相应的基因片段并构建含有相应基因序列的重组质粒,以所构建的重组质粒作为阳性标准品,建立了用于IFN-γ、IL-2及GAPDH检测的SYBR GreenⅠreal-time PCR方法。该方法线性关系良好,IFN-γ、IL-2和GAPDH标准曲线的相关系数均达0.99以上;敏感性高,初始模板的检出下限均达1×103copies/μL;特异性强,扩增产物形成单一的特异性融解峰;重复性好,组内与组间的变异系数均小于3%。应用该方法对传染性脓疱病毒感染羔羊外周血白细胞中的IFN-γ、IL-2 mRNA的表达水平进行了检测。结果表明,建立的real-time PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好等优点,可用于绵羊Th1型细胞因子的检测及定量分析。

摘要：CyPB作为亲环蛋白(cyclophilins,CyPs)家族成员之一,是环孢菌素A、K506、雷帕霉素等免疫抑制药物在细胞内的主要结合蛋白。本课题组前期利用抑制性消减杂交技术对羊传染性脓疱病病毒(orf virus,ORFV)感染MDBK前后宿主细胞差异基因进行筛选时发现,正向文库中CyPB显著上调表达,但其在ORFV侵染过程中的作用尚不清楚。为了进一步明确CyPB对ORFV侵染复制的影响,根据从GenBank中获取的牛源CyPB基因编码区全长651bp基因序列,设计1对针对牛源CyPB基因的特异性引物,利用RT-PCR方法扩增获得CyPB基因全长基因序列。将获得的CyPB基因连接至PET-32a载体,转化到BL21菌株中,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析可见在25 000处有与预期大小一致的蛋白条带。上述结果表明,本研究成功诱导表达纯化出His-CyPB融合蛋白,该结果将为针对牛源CyPB蛋白功能的研究提供重要的物质基础。