摘要：目的构建大肠埃希菌严谨反应蛋白编码基因relA的原核表达载体,通过生物信息学方法分析RelA蛋白的结构和功能,为阐明RelA介导细菌严谨反应的分子机制奠定基础。方法利用分子克隆技术得到relA的CDS序列,利用基因工程手段将CDS序列连接到原核表达载体pET-22b中,通过抗性基因筛选和双向测序验证,得到重组表达载体pET-22b-relA。采用Protparam、TMHMM、ProtScale ExPASy、PSORTⅡ、SignalP、InterPro、UniProt、NetPhos 3.1、NetNGlyc 1.0、NetOGlyc 4.0、Blast等生物信息学软件和数据库对大肠埃希菌RelA蛋白的理化性质、功能位点、翻译后修饰、三维结构及蛋白相互作用网络等生物学特性进行系统分析;利用Clustal X2和MEGA7.0软件对RelA蛋白进行基于氨基酸序列的同源性分析和系统进化分析。结果成功构建relA基因的原核表达载体pET-22b-relA。生物信息学分析RelA蛋白由744个氨基酸组成,相对分子质量84×103 Da,等电点6.29,有两个卷曲螺旋结构,无跨膜螺旋区,为亲水性蛋白。RelA的N-末端结构域包括PH和SYNTH,C-末端结构域包括TGS、α螺旋区、CC及ACT亚结构域;该蛋白主要在细胞质发挥功能,含有10个NTP结合位点,2个金属离子结合位点,16个合成酶活性位点,53个潜在的磷酸化位点和8个可能的糖基化位点;RelA在细菌之间高度保守,与大肠埃希菌RelA亲缘关系最近的是福氏志贺菌,其次是柯氏柠檬酸杆菌。结论RelA在细菌之间高度保守,提示其在细胞生命活动中具有重要功能,RelA通过与核糖体和tRNA的相互作用介导细菌的严谨反应,因此RelA是一种重要的翻译因子。本研究为全面揭示RelA分子的生物学功能,设计和筛选靶向RelA的新型抗菌药物提供了线索和依据。

摘要：目的:对SARS-CoV-2核衣壳(N)蛋白进行系统生物信息学分析和原核表达,阐明其功能和病毒RNA复制机制。方法:采用UniProt、NetPhos 3.1、IEDB和Blast等生物信息学软件对N蛋白的理化性质、蛋白互作网络、翻译后修饰、同源性及系统进化关系等生物学特性进行系统分析。构建原核表达质粒pET-22b-N并表达蛋白。结果:N蛋白是由419个氨基酸组成的碱性蛋白,分子量为45.62 kD,等电点为10.07,其N端有1个RNA结合结构域,C端有1个二聚体界面,有57个可能的磷酸化修饰和25个潜在糖基化修饰,15个T细胞抗原表位和11个线性B细胞抗原表位,无信号肽和跨膜螺旋,是一种亲水性蛋白。N蛋白中无规则卷曲占比最高(54.42%),其次为α-螺旋(22.20%)。与N蛋白序列一致性最高的是BtRs-β-冠状病毒/HuB2013和蝙蝠冠状病毒Rp/Shaanxi2011,进化分析显示SARS-CoV-2与蝙蝠非典型冠状病毒YNLF_31C聚为一支。原核表达后发现,细菌裂解液离心后的沉淀中有大量N蛋白表达,为后续蛋白纯化和结构分析提供了依据。结论:N蛋白在SARS冠状病毒和蝙蝠冠状病毒间高度保守,为SARS-CoV-2 N蛋白结构与功能研究提供了基础,为靶向N蛋白的抗病毒药物设计提供了依据。