摘要：为建立一种鱼类鳗弧菌的快速检测方法,本研究以鳗弧菌的tox R基因为靶基因设计特异性引物,并对反应条件和反应体系进行优化,建立了基于赖解旋酶DNA恒温扩增技术(HDA)的鳗弧菌快速检测方法。结果显示,该方法对鱼类鳗弧菌检测为阳性,而对其他鱼类病原菌的检测结果均为阴性,具有良好的特异性;标准菌株菌体基因组DNA最低检测限为30 ng/m L,人工污染模拟样品的最低检出限为2.1×102cfu/m L;利用该方法与普通PCR方法对临床120份鱼类样品进行检测,符合率为100%,检出率均高于细菌培养法。本研究建立的检测鳗弧菌的HDA法具有快速、简便、特异、灵敏等特点,适合基层实验室使用,具有广泛的应用前景。

摘要：依据白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,WSSV)的囊膜蛋白VP28基因核苷酸序列设计特异的锁式探针,建立了WSSV超分支滚环扩增检测方法并构建试纸条.结果表明,WSSV超分支滚环扩增锁式探针在T4DNA连接酶作用下37℃连接30min,而后在Bst DNA聚合酶大片段作用下61℃反应50min,即能够实现病毒靶序列的有效检出.灵敏度实验表明,WSSV超分支滚环扩增试纸最低检出限为10拷贝/μL,是常规PCR(聚合酶链式反应)法灵敏度的100倍.特异性实验表明,该方法能够保证对WSSV的特异性检测.利用该试纸检测68份虾样本,与PCR方法检测结果基本一致,但更为灵敏和直观.

摘要：为了建立可对鳕鱼DNA进行特异性检测的PCR方法,应用在出口贸易中的鳕鱼疑似样品和保护执法工作中难以检查辨认的鳕鱼产品的物种鉴定,从GenBank数据库下载7个鳕属及其他5种鱼类的mtDNA细胞氧化酶Ⅱ(COXⅡ)基因序列,并用DNA Star7.0软件对上述不同鳕鱼的该基因碱基序列进行比较。在此基础上,综合考虑了设计引物的基本原则,选择了鳕鱼与其他鱼类碱基序列上差异位点较多的两个片段,设计出PCR引物。用该引物分别对从7种鳕鱼和5种非鳕鱼的肌肉、脏器组织中提取的DNA进行PCR扩增。结果表明,所设计的引物对鳕鱼DNA具有特异性,从而达到了对该物种进行特异性检测鉴定的目的。

摘要：通过收集鲤春病毒血症病毒基因序列,设计了鲤春病毒血症病毒最为保守的指纹序列,以及测序引物,建立了鲤春病毒血症病毒焦磷酸测序检测方法。对所构建的鲤春病毒血症病毒焦磷酸检测方法进行特异性试验和灵敏度检测,试验结果表明所建立的方法特异性好,在8种鱼类病毒中能够特异性检测出目的病毒,检测方法灵敏度高,最低检出核酸量为10pg/μL。对建立的焦磷酸测序检测方法进行了实际应用研究,选取国内采集与进口的鱼类样本共计80批次进行鲤春病毒血症病毒检测。结果显示,焦磷酸测序检测方法可以有效的检出常规RT-PCR不能检出的假阴性样本和弱阳性样本,该方法的灵敏度和特异性可以满足水生动物疫病检测的需要。

摘要：为建立病毒性出血性败血症病毒(VHSV)焦磷酸测序检测技术,本研究通过对VHSV靶基因特异性序列的同源性分析,设计出适合焦磷酸测序特异性扩增和测序的引物,对焦磷酸测序反应体系和反应程序进行优化,建立了VHSV焦磷酸测序检测方法。结果表明,该方法仅对目的病毒基因扩增,而对其它病毒检测为阴性,表明该方法特异性好;该方法最低检出核酸量为82拷贝/μL,灵敏度高。选取国内采集与进口的鱼类样本共计1924批次进行VHSV检测,结果显示,焦磷酸测序检测方法检测结果与常规RT-PCR一致,该方法的特异性和灵敏度可以满足水生动物疫病检测的需要。

摘要：依据传染性皮下及造血组织坏死病毒(infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)的非结构蛋白NS1基因序列,设计特异的锁式探针,建立IHHNV病毒超分支滚环扩增(hyper-branched rolling circle amplification,HRCA)检测方法并构建试纸条.结果表明,IHHNV HRCA试纸的检测限可以达到10拷贝/μL,较常规PCR法高约2个数量级,且能够保证对IHHNV的特异性检测.利用该试纸条对国产与进口的42份虾样本进行IHHNV检测,结果显示,HRCA试纸条在灵敏度上优于常规PCR,且方法直观、更易于结果判定.

摘要：为建立鲤春病毒血症病毒(SVCV)的快速检测方法,本研究根据SVCV的G基因保守序列设计特异性引物,通过条件优化初步建立了基于重组酶聚合酶扩增技术(RPA)的SVCV检测方法。该RPA方法最优扩增温度为30℃,恒温反应20 min内即可完成。特异性试验结果显示,该方法与其它常见鱼类感染病毒无交叉反应;敏感性试验结果显示,该方法对SVCV质粒标准品的最低检出限为89.2拷贝/μL,高于传统的RT-PCR方法;利用已建立的RPA方法和RT-PCR方法对市场购买的80份临床样品进行检测,结果显示,RPA方法与RT-PCR方法检测结果一致,且RPA方法能够有效检出RT-PCR方法的弱阳性样品,表明RPA方法可以用于临床检测。本研究建立的检测SVCV的RPA方法具有快速、简便、特异性强、灵敏度高的特点,适合基层实验室及现地检测。

摘要：为建立一种同时检测对虾桃拉病毒、虾黄头病毒的液相芯片快速检测技术,用DNAStar软件对GenBank中对虾桃拉病毒的CP2基因和虾黄头病毒的N基因进行序列分析,设计对虾桃拉病毒、虾黄头病毒特异性引物并标记生物素。探针氨基化修饰,与荧光编码微球偶联后与对虾桃拉病毒、虾黄头病毒病毒RT-PCR产物杂交反应,用液相芯片仪器检测荧光信号。该检测体系对对虾桃拉病毒、虾黄头病毒病毒核酸检测灵敏度高,其最低检测限为100pg,且与白斑病毒、鲤春病毒血症病毒、传染性造血器官坏死病毒核酸等无交叉反应。该方法灵敏度及特异性高,为同时快速检测对虾桃拉病毒、虾黄头病毒提供了简捷快速的技术手段。

摘要：根据传染性造血器官坏死病毒(IHNV)基因序列,设计了IHNV最为保守的指纹序列,以及测序引物,建立了IHNV焦磷酸测序检测方法。对所构建的IHNV焦磷酸检测方法进行特异性试验和灵敏度检测。结果表明,所建立的方法特异性好,在8种鱼类病毒中能够特异性检测出目的病毒,检测方法灵敏度高,最低检出核酸量为10pg/μL。对建立的焦磷酸测序检测方法进行了实际应用研究,选取国内采集与进口的鱼类样本共计80批次进行IHNV检测。结果显示,焦磷酸测序检测方法可以有效的检出常规RTPCR不能检出的假阴性样本和弱阳性样本,该方法的灵敏度和特异性可以满足水生动物疫病检测的需要。

摘要：为建立检测鲤春病毒血症病毒(SVCV)的液相芯片快速检测技术,用DNAStar软件对GenBank中SVCV的G基因进行序列分析,设计SVCV特异性引物和探针并标记生物素,偶联荧光编码微球后与SVCV病毒RT-PCR产物杂交反应,用液相芯片仪器检测荧光信号。结果表明液相芯片检测体系能够正确的检测出SVCV。病毒核酸的最低检出量为10pg,检测特异性高,初步建立了检测SVCV的液相芯片技术,为进一步构建其他水生动物病原体全新快速高通量检测平台奠定基础。