摘要：背景:半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3在正常细胞中以酶原形式存在,受凋亡刺激因素作用后能够被激活从而引起细胞凋亡。目的:通过检测脑海马组织胞质S-100中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的活性及海马区神经元凋亡情况,探讨全脑缺血再灌注后脑海马神经元凋亡与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的关系。设计:随机对照实验。单位:解放军第三军医大学西南医院急救部。材料:实验于1999-01/04在解放军第三军医大学西南医院完成。选取雄性Wistar大鼠182只,随机分为3组:假手术组14只,脑缺血再灌注组84只,乙酰天冬氨酰谷氨酰缬氨酰天冬氨酸乙醛穴acetyl-asp-glu-val-asp-aldehyde,AC-DEVD-CHO雪治疗组84只,后两组均设立缺血再灌注8,24,48,72,120,168h6个时相点,每个时相点14只大鼠。方法:脑缺血再灌注组、AC-DEVD-CHO治疗组建立大鼠全脑缺血20min再灌注模型,分别于再灌注后8,24,48,72,120,168h处死取海马组织;假手术组施行麻醉及手术,但不夹闭颈总动脉和烧灼椎动脉,术后观察72h后处死取海马组织备检。以单位质量标本于单位时间内裂解产生的氨甲基香豆素量表示标本中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的活性。各组不同时相点脑组织切片封固后在荧光显微镜下于330～350nm处观察脑海马细胞凋亡情况。主要观察指标:①各组脑缺血再灌注后不同时相点海马组织S-100中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性变化。②各组脑缺血再灌注后不同时相点海马细胞凋亡的情况。③半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性与海马区神经元凋亡的关系。结果:实验纳入182只大鼠,脱落14只,共168只大鼠进入结果分析。①各组脑缺血再灌注后不同时相点海马组织S-100中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性变化:假手术组术后观察72时为0。与脑缺血再灌注组比较,AC-DEVD-CHO治疗组于再灌注24,48,72,120,168h均明显降低眼(1.71±0.03),(1.22±0.03);(2.77±0.09),(1.59±0.7);(5.54±0.51),(2.3±0.19);(6.28±1.71),(3.43±0.46);(3.11±1.21),(1.73±0.14)nkat/kg;P<0.05或0.01演。②各组脑缺血再灌注后不同时相点海马细胞凋亡的情况:每400倍视野下,假手术组术后观察72h为(1.2±0.4)个。与脑缺血再灌注组比较,AC-DEVD-CHO治疗组于再灌注24,48,72,120,168h均明显降低眼(6.4±1.7),(2.8±0.8);(11.8±1.3),(5.8±1.9);(19.8±3.1),(10.0±1.9);(31.2±5.9),(16.4±2.4);(19.8±2.3),(9.0±2.3)个/400倍视野;P<均0.01演。③半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性与海马区神经元凋亡的关系:脑缺血再灌注组、AC-DEVD-CHO治疗组均行直线相关分析,二者的变化呈显著正相关(r分别为0.9356及0.9800,P均<0.01)。结论:半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的激活是引起海马神经元调亡的主要因素之一,在缺血再灌注大鼠脑海马神经元凋亡中起着重要作用。

摘要：背景：研究发现NOTCH-1信号通路在神经干细胞或神经前体细胞的自我更新、增殖及分化中起重要作用。目的：探讨NOTCH-1信号通路在人脑胶质瘤干细胞增殖和分化过程中的调控作用。设计、时间及地点：开放性实验,于2005-01/2007-03在解放军第三军医大学新桥医院完成。材料：人脑胶质瘤组织、正常成人脑组织由解放军第三军医大学新桥医院神经外科提供。U251胶质瘤细胞株由解放军第三军医大学新桥医院神经外科吕胜青副教授惠赠;CHG-5胶质瘤细胞株由解放军第三军医大学西南医院病理研究所卞修武教授、姚晓红博士惠赠。方法：取人脑胶质瘤组织、正常成人脑组织、U251及CHG-5胶质瘤细胞株,采用免疫磁珠法分选获得CD133^＋脑胶质瘤干细胞,加入DMEM/F12无血清培养基进行增殖培养,形成细胞克隆后,加入含体积分数为10%胎牛血清的培养液,2h后行抗CD133和抗巢蛋白免疫荧光双标染色。主要观察指标：人脑胶质瘤干细胞的生长和鉴定,采用WST-8法、免疫组化实验、流式细胞仪、免疫荧光双标实验检测NOTCH-1信号通路蛋白的表达。结果：在无血清培养基中,细胞呈悬浮生长,培养24-48h可见单个细胞开始分裂生长,形成肿瘤球,将肿瘤球转入含胎牛血清的培养基后,4h周边细胞伸出突起并逐渐分化,24h后肿瘤球迁移出的细胞增多,形成单细胞层。肿瘤球能同时表达干细胞标志物CD133和巢蛋白,CD133^＋脑胶质瘤干细胞核浆比例达2/3-3/4,突起少,胞浆中线粒体等细胞器较少,核糖体丰富,未见胶质丝等分化结构,符合干细胞超微结构特点。NOTCH-1蛋白在人脑胶质瘤组织中的表达明显强于正常成人脑组织（P〈0.01）,在CD133＋U251及CHG-5胶质瘤细胞中有很强的表达,在GFAP＋和MAP2＋U251及CHG-5胶质瘤细胞中的表达强弱不等,在MBP＋U251及CHG-5胶质瘤细胞中呈弱表达或不表达。在脑胶质瘤干细胞增殖过程中能检测到较强的NOTCH-1信号通路关键基因NOTCH-1,CBF-1,HES-1mRNA及NOTCH-1,HES-1蛋白表达;而在细胞分化时NOTCH-1信号通路关键基因NOTCH-1,CBF-1,HES-1mRNA和HES-1蛋白表达逐渐减弱。结论：NOTCH-1信号通路的关键蛋白分子NOTCH-1在人脑胶质瘤组织和胶质瘤细胞株中均有表达,而在正常成人脑组织中仅微弱表达。NOTCH-1信号通路关键基因NOTCH-1和HES-1的表达强弱可能参与了胶质瘤干细胞增殖和分化的调控。