摘要：近年来,水产动物模型在鱼病防控方面的应用越来越广泛。其具备遗传背景清晰、条件可控性强等优点,是鱼病防控基础研究的有效工具之一。本文论述了水产动物模型的建立方法以及在鱼类疾病病原分析、疫苗开发和水质监测方面应用的研究现状,并对水产动物替代模型的发展前景做了简要论述。

摘要：为建立一种特异性强、灵敏度高、操作便捷的Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(GCRV-Ⅱ)检测方法,研究利用重组酶介导链置换核酸扩增技术(Recombinase-aid amplification,RAA)与成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统相结合,构建了GCRV-Ⅱ病毒RAA结合CRISPR/Cas12a可视化“一步”快速检测方法。首先选择GCRV-Ⅱ毒株间序列保守,不同基因型GCRV间差异明显的s6基因(GQ896337)的保守区设计5对RAA候选引物和2对crRNA,合成并筛选出特异性引物和crRNA组合。其次测试反应的特异性、灵敏度和准确性。最后建立下层扩增相、上层检测相的“一步法”反应体系。该检测方法在37℃恒温下反应可检测出GCRV-Ⅱ,最低检测限为10^(2) copies/μL。对24份临床样本进行检测,该检测方法阳性检出率高于现行国标PCR法。研究建立的GCRV-Ⅱ检测方法操作便捷、特异性高、灵敏度好、可重复性强、与设备兼容性好、在蓝光灯下可通过肉眼判断检测结果。

摘要：本研究根据GenBank中发表的猪瘟病毒(CSFV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的基因组序列,设计筛选出两对用于双重RT-PCR反应的特异性引物,通过对特异性、灵敏性和稳定性等试验,建立了检测猪流行性腹泻病毒和猪瘟病毒的双重RT-PCR核酸检测技术。利用建立的CSFV-PEDV双重RT-PCR核酸检测技术,对某规模化猪场病料进行检测,结果表明,扩增出大小约311 bp和501 bp大小的特异性条带,为猪瘟与猪流行性腹泻病毒混合感染。建立的CSFVPEDV双重RT-PCR核酸检测技术具有良好的特异性、灵敏性和稳定性,该方法的建立为CSFV和PEDV的快速诊断、疫情监测及流行病学研究奠定了基础。

摘要：罗非鱼湖病毒TiLV是一种新发RNA病毒,对罗非鱼养殖业造成巨大威胁。为明确罗非鱼(Oreochromis niloticus)多聚免疫球蛋白受体基因(OnpIgR)的序列和结构特征及其对TiLV增殖的影响,本研究首先对PCR扩增获得的OnpIgR完整的ORF,进行了结构域预测、三维结构预测以及遗传进化树分析,然后采用荧光定量PCR方法分析了罗非鱼感染TiLV后该基因在各组织的表达模式,最后构建了OnpIgR过表达质粒,初步研究了OnpIgR对TiLV增殖的影响。结果表明,PCR扩增获得了完整的OnpIgR ORF序列,长度为1023 bp,该ORF序列具有一个信号肽,两个Ig样结构域,同源建模结果显示,pIgR蛋白整体呈扭曲的“L”型,主要由反平行β片层和无规卷曲组成;系统发育树显示OnpIgR与大口黑鲈(Micropterus salmoides)以及斜带石斑鱼(Epinephelu coioides)的pIgR聚为一支;感染TiLV后,罗非鱼皮肤、脾脏以及肾脏中pIgR均呈现先上升后下降的趋势;成功构建了pEGFP-OnpIgR并在TiB细胞中过表达OnpIgR后感染TiLV,发现TiLV的S8和S10节段mRNA相对表达量显著增多,TiLV拷贝数也显著增多,初步表明OnpIgR对TiLV的增殖具有促进作用。

摘要：【目的】制备抗罗非鱼湖病毒(Tilapia Lake Virus,TiLV)S10节段基因编码蛋白的单克隆抗体(Monoclonal antibody,MAb)。【方法】构建含有TiLV S10基因节段的重组表达质粒pET32a-S10,并将其转化至BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达和镍柱纯化获得高纯度重组S10蛋白;用纯化的重组蛋白免疫6~8周龄雌性BALB/c小鼠多次后,取其脾细胞与SP2/0细胞进行融合获得杂交瘤细胞,采用有限稀释法和ELISA方法,筛选获得2株能稳定分泌抗S10蛋白MAb的杂交瘤细胞株,分别命名为2C3和2E3,并对其特异性、亚型和效价进行分析。【结果】Western blot结果显示,2C3和2E3均能识别S10重组蛋白及TiLV,间接免疫荧光试验(IFA)结果表明,2C3和2E3只与TiLV感染的TiB细胞呈阳性反应。亚型检测结果显示,2C3抗体为IgG1/к型,2E3抗体为IgG2a/к型。抗体效价测定结果表明,两种MAb的效价分别为1∶12800,1∶51200。【结论】抗TiLV-S10蛋白MAb特异性强、效价高,可为后续TiLV疫苗的研发、免疫学方法的建立及S10蛋白功能的研究提供重要材料和支撑。

摘要：罗非鱼湖病毒(TiLV)感染引起的罗非鱼湖病毒病(TiLVD)对全球的罗非鱼养殖业造成了严重威胁。TiLV不仅可感染罗非鱼及其变种,也可感染其他鱼类。稀有鮈鲫是一种优良的小型实验鱼,为探究TiLV对稀有鮈鲫的感染特性,用毒株 TiLV-2017A 对稀有鮈鲫进行腹腔注射感染,对感染后稀有鮈鲫的临床症状、病毒载量、组织病理和免疫基因的表达进行分析。结果表明:TiLV-2017A可感染稀有鮈鲫,死亡率约为10%,病毒载量在第13天达到峰值,为1.582×10;拷贝数·μL^(-1);对相关免疫基因进行检测,发现稀有鮈鲫白细胞介素-8(IL-8)、NK细胞增强因子(NF-κB)、白细胞介素-1β(IL-1β)、Mx蛋白(Mx)、Toll样受体3(TLR3)、髓样分化因子(MyD88)、α-干扰素(IFN-α)和 Toll 样受体 5(TLR5)等免疫相关基因在各组织中均有不同程度的上调,在肠中上调较为显著。H.E染色结果显示肝脏中肝细胞肿大、脾脏和肾脏中噬铁血黄素增加、鳃组织中鳃丝部分断裂等病理症状。