摘要：针对当前我国流行的猪圆环病毒(porcine circovirus,PCV)1型(PCV1)、2型(PCV2)和3型(PCV3),设计3对特异性引物,通过对引物浓度、退火温度和循环次数的优化,建立了鉴别检测PCV1、PCV2和PCV3的三重PCR方法。结果显示,该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,只能检出PCV1、PCV2和PCV3,其他猪病毒均未能扩出;对PCV1、PCV2和PCV3质粒标准品的检测下限分别为3.63×10^(3),3.63×10^(1),3.63×10^(2)拷贝/μL;相同条件下的扩增获得均匀一致的结果。利用所建立的三重PCR方法检测2018—2020年采自广西各地的1308份猪组织病料,结果显示,PCV1、PCV2和PCV3的阳性率分别为2.14%,56.65%,5.58%,并存在混合感染现象;PCV1、PCV2阳性率逐年下降,PCV3阳性率稳定控制,不同地市之间阳性率有所差异。结果表明,本研究成功建立了一种快速、特异、灵敏、经济的三重PCR方法,可用于PCV1、PCV2和PCV3的鉴别检测和流行病学调查;当前广西猪群普遍感染PCV1、PCV2和PCV3,应加强防控。

摘要：为建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的快速鉴别检测方法,本研究针对PRRSV基因序列设计3对特异性引物,即第1对通用引物扩增美洲型和欧洲型病毒株ORF7基因(433 bp/398 bp)、第2对引物扩增美洲型经典病毒株和高致病性变异株(HP-PRRSV)Nsp2基因(338 bp/248 bp)、第3对引物扩增欧洲型病毒株ORF5基因(614 bp)。经过反应条件的优化,建立了能够同时检测并区分美洲型经典病毒株、HP-PRRSV株以及欧洲型病毒株的多重RT-PCR检测方法。该方法可以特异扩增3种病毒的基因,其重组质粒标准品的检出下限均为1.67×103拷贝;而与猪的其它重要病原均无交叉反应。应用该方法检测176份临床疑似病料样品,结果 PRRSV阳性45份,其中美洲型变异病毒株41份、经典病毒株4份,未检测到欧洲型病毒株。表明本研究建立的多重RT-PCR检测方法可以用于PRRSV的快速鉴别诊断和流行病学调查。

摘要：为建立鉴别检测A型塞尼卡病毒(SVA)与O型、A型、亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒(FMDV)的方法,针对SVA 3D基因与O型、A型、亚洲Ⅰ型FMDV VP1基因,分别设计特异性引物和TaqMan探针,经优化反应条件,建立了同时检测SVA与O型、A型、亚洲Ⅰ型FMDV的TaqMan荧光定量RT-PCR方法。所建立的方法能特异性扩增SVA及O型、A型、亚洲Ⅰ型FMDV,与其他主要猪源病毒无交叉反应;对SVA与O型、A型、亚洲Ⅰ型FMDV质粒标准品的检出下限分别为2.50×10^(1)、2.50×10^(2)、2.50×10^(2)、2.50×10^(2)copies/μL;组内与组间重复性试验的变异系数均小于2%。应用所建立方法检测2019年来自广西的30份临床疑似样品,SVA和O型FMDV的检出阳性率分别为20%和70%,而未能检出A型和亚洲Ⅰ型FMDV。结果表明,本研究所建立的多重荧光定量RT-PCR方法为SVA与O型、A型、亚洲Ⅰ型FMDV的临床检测和流行病学调查提供了特异、敏感、高效的技术手段。

摘要：为建立鸡新城疫病毒(NDV)和鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的快速鉴别检测方法,本研究根据NDV和IBV的基因保守序列,设计了2对特异性引物和2条用不同荧光基团标记的Taq Man探针;经过对反应条件的优化,建立了能够同时检测NDV和IBV的双重荧光定量RT-PCR方法。该方法对NDV和IBV的检测灵敏度均为10拷贝/μL,比常规RT-PCR敏感性高100倍;该方法对禽流感病毒、传染性喉气管病病毒、鸡白血病病毒、禽呼肠弧病毒检测结果均为阴性,表明其具有良好的特异性;批内和批间重复变异系数均小于2%。利用所建立的双重荧光定量RT-PCR方法及常规RT-PCR,对185份组织样品进行检测,符合率为100%。该方法可以用于NDV和IBV的快速定量检测。

摘要：为研究鸡传染性支气管炎病毒（IBV）广西流行株的遗传变异情况,本研究从广西发病鸡中分离鉴定了1株IBV。参照GenBank中IBV的核苷酸序列设计2对引物,利用RT-PCR技术对分离毒株的N、M基因进行了克隆、序列测定,并与GenBank中发表的国内外参考毒株进行比对分析。结果显示,N基因序列全长为1 230bp,编码409个氨基酸,M基因序列全长为678bp,编码225个氨基酸。与参考毒株相比,分离株的N基因核苷酸序列同源性为87.2%~93.3%,推导的氨基酸序列同源性为90.0%~94.4%;M基因的核苷酸序列同源性为83.6%~91.0%,推导的氨基酸序列同源性为82.7%~92.9%。在遗传进化树中,本试验分离株Guangxi156株与BJ株和LX4株两个参考株位于同一个分支上,亲缘关系较近,而与其他参考株属于不同的分支,亲缘关系较远。结果表明,本试验分离株是一株新的IBV变异株。

摘要：为建立鉴别检测鹅细小病毒(GPV)、番鸭细小病毒(MDPV)及鸭圆环病毒(DuCV)的方法,本研究分别针对GPV、MDPV NS基因与DuCV Rep基因,设计特异性引物和TaqMan探针,经优化反应条件,建立了同一体系中同时鉴别检测GPV、MDPV及DuCV的TaqMan荧光定量PCR方法。利用该方法检测GPV、MDPV、DuCV及禽流感病毒、新城疫病毒、鸭瘟病毒、减蛋综合征病毒、鸭坦布苏病毒、番鸭呼肠孤病毒等主要水禽源病毒,结果显示,该方法仅能扩增出GPV、MDPV及DuCV,与其他主要水禽源病毒均无交叉反应,特异性强;利用该方法检测等体积混合后的GPV、MDPV及DuCV质粒标准品混合物,结果显示,该方法对3种质粒标准品的检测限均为7.5×10^(1)拷贝/μL,普通单一PCR对上述3种质粒标准品混合物的检测限均为7.5×10^(3)拷贝/μL,表明本研究建立方法的敏感性高于普通PCR;该方法组内与组间重复性试验的变异系数均小于2.0%,重复性好。利用该方法与MDPV和GPV双重荧光定量PCR方法及DuCV荧光定量PCR方法同时检测96份临床发病鸭的组织样品,该方法检测结果显示,共检出58份阳性样品,其中GPV检出率为18.75%(18/96),MDPV检出率为4.17%(4/96),DuCV检出率为37.50%(36/96),GPV与DuCV混合感染率为8.33%(8/96),阴性样品38份。与GPV和MDPV双重荧光定量PCR及DuCV荧光定量PCR方法的检测结果均一致,三者的符合率达100%。本研究建立的GPV、MDPV及DuCV多重TaqMan荧光定量PCR方法为临床鉴别检测该3种病原及其流行病学调查提供了特异、敏感、高效的技术手段。

摘要：以山羊痘弱毒疫苗毒株AV41的细胞培养物中提取的总DNA为模板,通过PCR扩增获得山羊痘病毒(GTPV)ORF122基因片段。另设计1对引物,经PCR扩增获得缺失跨膜功能区的ORF122基因片段,将其克隆入原核表达载体pET-32a中,构建了重组表达质粒pET-ORF122,将其转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导,成功表达出分子质量为32ku的融合蛋白。免疫印迹试验证实,表达的融合蛋白可以被GTPV阳性血清识别。经对该重组蛋白进行纯化,结果其纯度达到90%以上,产量达5.5mg/L。上述结果为GTPV重组诊断抗原的筛选和新型疫苗的研制奠定了基础。

摘要：为了建立能同时检测H5、H7和H9亚型禽流感病毒(AIV)的方法,参考GenBank中H5、H7和H9亚型AIV的HA基因序列的保守区域,利用Primer 5.0软件设计3对分别针对AIV H5、H7和H9亚型的特异性引物,预期特异扩增H5AIV片段大小为380bp、H7AIV为501bp、H9AIV为732bp。经过反应条件的优化,建立了同时检测H5、H7和H9亚型AIV的一步法多重RT-PCR方法。该方法特异性强,对其他亚型AIV和禽呼吸道病原体检测结果为阴性;敏感性高,H5、H7和H9亚型AIV RNA的最低检出量分别为10-4、10-4、10-2拷贝/μL。初步建立了快速、敏感、特异地鉴别检测H5、H7和H9亚型禽流感病毒的分子生物学诊断方法。

摘要：参照GenBank中鸡传染性支气管炎病毒（IBV）的核苷酸序列设计1对引物,利用PCR扩增IBV广西株的M基因片段,将其克隆到pMD18-T载体中。序列分析结果表明,M基因全长为678bp,编码225个氨基酸,近N端含有2个潜在的N-糖基化位点,3个跨膜区位于23—98肽段区,亲水区较疏水区更易变异。IBV广西株与国内外IBV参考毒株相比,核苷酸序列同源性为83.6%-92.5%,氨基酸序列同源性为82.7%-95.1%。系统进化分析结果显示IBV广西株与SAIB20和LX4两参考株位于同一个分支上,它们的亲缘关系较近,而与其他参考株属于不同的分支,亲缘关系较远。结果表明IBV广西株是1株新的IBV变异株。

摘要：用设计的特异性引物,通过RT-PCR法对2013年间分离自广西的具有一定代表性的2株鸡新城疫病毒（GX-79-13-Ch,GX-117-13-Ch）进行HN基因的扩增和克隆,并对其进行核苷酸序列测定和分析。2毒株HN基因开放性阅读框架（ORF）均为1 716 bp,二者之间的核苷酸序列同源性为99.5%,氨基酸同源性为99.0%。2个分离株HN基因核苷酸序列与国内外报道的相关序列同源性为81.2%~97.5%,推导氨基酸序列同源性为88.2%~97.6%。由系统发育树可见,与现今流行于国内的Ⅶ型病毒株有较高的同源性,表明2个分离株与现今流行于国内的Ⅶ型病毒株有密切联系。