摘要：对贵州省2002年以来发生的疑似山羊痘病例样品进行了病毒的分离与鉴定。取山羊痘病羊的皮肤痘疹和水疱作待检病料,接种BHK-21传代细胞盲传3代后,出现了明显的、规律的细胞病变(CPE),病毒细胞培养物在F4代以后,能与山羊痘标准阳性血清在琼脂扩散试验中出现白色沉淀线,而与正常细胞的培养物及PBS不出现沉淀线;参照GenBank上山羊痘病毒P32基因序列,设计了1对特异性引物,对现场分离毒株进行PCR扩增,可扩增出963bp特异性的DNA条带。用待检病料感染的BHK-21细胞培养物接种9日龄鸡胚绒毛尿囊膜,随着传代次数的增加,痘斑病变的出现率从13.3%～20%上升至33.3%～40%;用山羊痘病变皮肤、鸡胚绒毛尿囊膜和感染细胞进行超薄切片,在电子显微镜下可以观察到典型的山羊痘病毒粒子。

摘要：为建立一种能同时检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的双重PCR方法,根据MG gapA基因和MS vlhA基因设计合成特异性引物,通过对双重PCR扩增条件的优化,建立能够同时检测MG和MS的双重PCR方法。结果显示,双重PCR反应条件中最适退火温度为58℃,反应体系中最适模板浓度为5.76 ng/μL,最适引物量为1.25μL(10 mmol/L)。特异性试验显示,所建PCR方法对MG、MS、MG/MS混合培养物均可扩增出相应的特异性条带,而对AIV疫苗、NDV疫苗、MO、***、SE的基因组扩增结果均为阴性;敏感性试验显示,该方法对MS、MG最低检出核酸终浓度分别为0.045 ng/μL和0.09 ng/μL;临床应用性试验显示,所建立的双重PCR方法可同时有效地检测出MG和MS核酸。结果表明,该双重PCR具有良好的特异性、敏感性、临床应用性,可以用于临床病料中MG和MS的快速检测,为MG和MS感染的诊断和流行病学监测提供了一种简便适用的方法。

摘要：为储备禽腺病毒病疫情防控技术,应用DNAStar软件分析GenBank中Ⅰ群禽腺病毒血清4型(FAdV-4)全基因序列,选取Hexon基因的保守区域设计合成1对PCR引物和1条TaqMan探针,建立FAdV-4FQ-PCR检测方法,得到相应的标准曲线,并应用该方法对临床病例和人工感染动物进行FAdV-4核酸检测。结果表明,建立的FAdV-4FQ-PCR方法具有良好的敏感性、特异性、稳定性和临床应用性。

摘要：本研究旨在建立牛支原体Taqman探针实时荧光定量PCR方法,便于临床上快速检测、诊断牛支原体病。本研究根据牛支原体TU基因(登录号:CP002188.1)设计合成特异性引物及Taqman探针,并通过试验检验所建立的检测方法的特异性和灵敏性。本研究建立的实时荧光定量PCR方法标准曲线的截距为46.20,斜率为-3.24,相关系数为-0.996,提示标准品的浓度与Ct值呈线性关系。方法性能评价显示,所建方法的组内及组间重复性变异系数均低于0.02,说明所建方法的重复性好;灵敏性试验中,目的基因最小检出浓度为19.1 copies/μL,敏感性是常规PCR(1.91×10^(4)copies/μL)的1 000倍。试验结果表明,本研究建立的牛支原体荧光定量PCR方法,具有精确、敏感、特异等优点,可为临床上快速检测牛支原体病提供技术支撑。

摘要：利用DNAStar分析了GenBank中所有8株羊痘病毒全基因序列,选取位于山羊痘病毒(AY077835)基因组gp064区域约64bp的基因片段,设计并合成了一对PCR引物和一条TaqMan-MGB探针,建立了FQ-PCR和标准曲线,并利用该方法对山羊痘临床皮肤痘疹材料和人工感染动物材料进行GPV核酸检测。结果表明,构建的FQ-PCR具有良好的敏感性、特异性、稳定性和临床应用性。该方法的建立为山羊痘临床快速高效地诊断和山羊痘病毒感染羊只的发生、发展及转归研究提供了一种有效的手段。

摘要：由安卡拉病毒引起的鸡心包积液-肝炎综合征发病急,传播速度快,造成雏鸡的高死亡率。为快速确诊,实现早发现早控制,本试验根据安卡拉病毒主要结构蛋白六邻体(Hexon)基因序列,设计1对特异性引物,优化反应体系,并对其进行特异性、敏感性和临床样本检测,以期建立检测安卡拉病毒的PCR方法。结果显示,可扩增出295 bp特异性片段,最佳模板质量浓度确定为4.38×10^(-2) g/L,最佳退火温度为58℃。该方法具有较好的特异性、灵敏性和临床应用性,可对临床FAdV-4感染病例作出快速检测,为疫病的快速鉴别诊断、及时防控提供参考价值。

摘要：为探讨小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)贵州流行株N基因分子特征和分群,试验设计了1对特异性引物,应用RT-PCR技术对小反刍兽疫(peste des petits ruminants,PPR)临床样本进行N基因扩增,克隆至pMD19-T载体,对阳性重组质粒进行测序,应用DANStar软件对测序序列和参考序列进行核苷酸同源性、氨基酸同源性、变异位点及系统进化树分析。结果显示:PPRV贵州流行株N基因扩增长度为1 578bp,其相互间核苷酸、氨基酸同源性分别为99.6%~100.0%及99.2%~100.0%,与国内参考株N基因的核苷酸序列(97.7%~99.9%)及氨基酸序列(98.3%~100.0%)同源性较国外参考株(88.5%~97.7%和92.2%~98.5%)高;PPRV贵州流行株N基因编码的氨基酸同疫苗株Nigeria 75-1相比存在26个位点突变,但没有氨基酸的缺失或增加;基于N基因系统进化分析显示,PPRV贵州流行株同国内参考株处于同一个进化分支,但与国外参考株处于不同进化分支;其属于病毒进化的Ⅳ基因群,与国内参考株处于同一系统分群,但与疫苗株Nigeria 75-1(Ⅰ基因群)处于不同基因群。

摘要：【目的】分析不同品种羊Toll样受体(TLRs)基因转录水平的差异性,为揭示TLRs基因转录水平与羊疫病间的关联性提供参考依据。【方法】选取贵州省主要饲养的贵州黑山羊、贵州白山羊、黔北麻羊、波尔山羊和湖羊为研究对象,根据GenBank已公布的TLRs基因序列设计荧光定量PCR特异性扩增引物及TaqMan探针引物,利用TaqMan探针荧光定量PCR检测不同品种羊血液和肺脏中TLR1~TLR10基因转录水平差异。【结果】TLR1~TLR10基因在不同品种羊血液和肺脏中均有转录表达。不同品种羊血液和肺脏中的TLRs基因转录水平均存在差异性,在波尔山羊血液中TLR2、TLR4和TLR5基因转录水平均极显著低于其他4种羊(P<0.01,下同),TLR7和TLR8基因转录水平则极显著低于除黑山羊外的其他3种羊;在白山羊血液中TLR4、TLR7、TLR8和TLR9基因转录水平极显著高于其他4种羊;在湖羊肺脏中TLR2、TLR3、TLR4、TLR5和TLR8基因转录水平极显著低于其他4种羊,而在黔北麻羊肺脏中TLR5和TLR8基因转录水平极显著高于其他4种羊。此外,在5种羊血液中TLR2、TLR4、TLR7和TLR8基因转录水平均极显著高于其他TLRs基因转录水平;羊肺脏中TLR2、TLR3、TLR4、TLR5和TLR8基因转录水平相对较高,在贵州白山羊、贵州黑山羊和波尔山羊均表现为极显著高于其他TLRs基因转录水平。【结论】不同品种羊血液和肺脏中TLRs基因转录水平具有差异性,以TLR2、TLR3、TLR4、TLR5和TLR8基因转录水平相对较高,提示TLRs在不同品种羊机体中发挥着清除病原体及维持机体稳态的作用,而TLRs基因转录水平差异可能是造成不同品种羊对疫病易感差异的原因之一。

摘要：比较Trizol法和SDS-蛋白酶K法提取山羊痘病毒DNA后,根据山羊痘病毒P32基因设计引物,建立了能检测感染细胞培养物与组织病料的PCR方法,结果显示以SDS-蛋白酶K法提取的病毒DNA在含量与纯度上均明显高于Trizol法;该PCR方法对山羊痘标准毒株细胞感染物能扩增出特异性的DNA条带,最小检出量为40.625ng;且能检出山羊痘疫苗毒Y株、贵州现场分离毒LD株和QL株的细胞感染物以及山羊痘疹样本中病毒DNA,而对鸡痘疫苗毒株感染细胞、正常细胞及正常山羊皮肤均为阴性反应。这些结果表明,建立的PCR方法具有特异性强、可靠性好、灵敏度高等特点,可用于山羊痘的临床诊断。

摘要：为了解安卡拉病毒贵州流行株penton基因分子特征,本试验参考GenBank上FAdV基因序列设计合成特异性引物,对penton基因CDS区进行扩增,运用生物信息学软件对penton基因的核苷酸序列、蛋白质理化性质、信号肽、二级结构、三级结构和B细胞表位进行分析。结果显示,3株FAdV(GZ-BJ、GZ-QL、GZ-LPS)penton基因片段大小均为1578 bp。系统进化树分析显示,GZ-BJ、GZ-QL、GZ-LPS均属于FAdV-4型,3株FAdV-4核苷酸同源性在99.9%~100%之间,推导氨基酸序列同源性在99.8%~100%之间;与国内其他分离株、国外分离株差异不大。蛋白理化性质分析显示,该蛋白属于不稳定的、不具有跨膜结构的亲水蛋白,其二级结构主要以无规则卷曲为主(54.29%);结构域预测结果显示,penton蛋白只含有一个低复杂度区域;B细胞表位预测发现,penton基因编码的氨基酸可能存在3个优势抗原表位区,分别为5-171、207-236和420-462位氨基酸处。本试验结果表明,安卡拉病毒penton基因相对保守,存在多个优势抗原表位,可作为安卡拉病毒防控研究靶蛋白,为该病毒防控与致病机理研究奠定基础。